【正文】 此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。反之，用mol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH ~)，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。7H2O 瓊脂 15~25g蒸餾水 1000ml自然pH實(shí)驗(yàn)及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO43H2O MgSO4培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。在這些培養(yǎng)基中，就營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類。實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。(2) 在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？(3) 用油鏡觀察時(shí)，為什么要在載玻片上滴加香柏油？實(shí)訓(xùn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。B. 在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。 將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約 0．5cm處，由目鏡觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。在對(duì)光時(shí)，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。B. 調(diào)節(jié)光源，對(duì)光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=1．25），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出0．22μm間的距離。 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L(zhǎng)度為0．55μm，假如數(shù)值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0．42μm。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長(zhǎng)越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來(lái)。如光線入射角為120176。 因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖Ⅲ5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過(guò)玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點(diǎn)上看得最清晰時(shí)，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時(shí)，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。223。食品微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)劉后偉、林丹瓊、劉旭光適合專業(yè)：綠色食品加工專業(yè) 食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè) 農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)專業(yè)實(shí)訓(xùn)一 顯微鏡的操作與使用實(shí)驗(yàn)1: 顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法1. 目的要求(1) 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。 油鏡物鏡的基本原理 微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10）、高倍物鏡（4mm，40—45）和油鏡（1．8 mm，95—100）三種。使用時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。 利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。同時(shí)，α的理論限度為90176。其半數(shù)的正弦為sin60176。因此，一個(gè)高的分辨力意味著一個(gè)小的可分辨距離，這兩個(gè)因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說(shuō)成是多少微米或納米，這實(shí)際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來(lái)了。而在0．42μm以下的兩點(diǎn)之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。3. 材料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、微生物制片標(biāo)本等。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。凡檢查染色標(biāo)本時(shí)，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。(3) 高倍鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。C. 從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過(guò)猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。F. 觀察完畢，上旋鏡筒。G. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 明確培養(yǎng)基的配制原理。各類微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類繁多。瓊脂只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。霉菌和酵母菌的pH偏酸；細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。7H2O FeSO43H2O，MgSO4實(shí)驗(yàn)步驟1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。同時(shí)．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。 對(duì)于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。(4) 過(guò)濾 趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。 圖11 培養(yǎng)基的分裝 A 漏斗分裝裝置 ；B 自動(dòng)分裝裝置 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)節(jié) ；7 裝量調(diào)節(jié) ；8開關(guān)分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。加塞時(shí)的棉塞的總長(zhǎng)度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。(8) 滅菌 ，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。然后用雙層紗布過(guò)濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加熱煮沸后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水。實(shí)驗(yàn)作業(yè)（選做3題）1．牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜?2．配制高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，可溶性淀粉需經(jīng)什么處理后才能倒入到沸水中? 3．何謂培養(yǎng)基的自然pH?4．培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無(wú)菌的5．在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?6．配制合成培養(yǎng)基加入微量元素時(shí)最好用什么方法加入?天然培養(yǎng)基為什么不需要另加微量元素?7．有人認(rèn)為自然環(huán)境中微生物是生長(zhǎng)在不按比例的基質(zhì)中，為什么在配制培養(yǎng)基時(shí)要注意各種營(yíng)養(yǎng)成分的比例?8．你配制的高氏I號(hào)培養(yǎng)基有沉淀產(chǎn)生嗎?說(shuō)明產(chǎn)生或未產(chǎn)生的原因。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G表示。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。3. 材料及器材(1) 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌(2) 革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等4. 方法與步驟(1) 涂片將培養(yǎng)14—16小時(shí)的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過(guò)于濃厚），干燥、固定?！?4) 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。革蘭氏染色過(guò)程：5. 實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1) 在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌？(2) 作革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)四 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)()一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法二、原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，(+)反應(yīng)。(1)．標(biāo)記試管 取5支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)(用“+”表示)；若不呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陰性反應(yīng)(用“”表示)。培養(yǎng)液→指示劑→珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH ，使甲基紅指示劑變紅。 實(shí)驗(yàn)六 吲哚試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者胚嵩囼?yàn)(Ehrlich法)的原理和方法：學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)(Ehrlich法)試驗(yàn)的操作技術(shù)。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，枯草芽孢桿菌。取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管3支，分別標(biāo)記大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽(yáng)性用“+”；陰性用“”表示。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，愛得華氏菌（Edwardsiella sp） (2)培養(yǎng)基 ONPG培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。二、原理 細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否含有代謝這種含碳化合物有關(guān)的酶，因而可作為鑒定的依據(jù)。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體中撮搞培養(yǎng)或加入45℃左右的固體培養(yǎng)基中，用力振蕩后立即倒成平板。試驗(yàn)時(shí)，往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加糖類1％或醇、％—％，％。如兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次，如差別仍不明顯，則為陰性。 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等．四、方法與步驟 取丙二酸鈉培養(yǎng)基試管三支，于其上分別做好培養(yǎng)基名稱和“大腸桿菌”及“沙門氏菌”及“空白對(duì)照”等標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)五 葡萄糖銨試驗(yàn)—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解葡萄糖銨試驗(yàn)的用途及原理。三、實(shí)驗(yàn)材料1) 菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌（Shigelle flexneri）2) 培養(yǎng)基 葡萄糖銨培養(yǎng)基(附錄Ⅲ8),普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。3） 接種 用無(wú)菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對(duì)應(yīng)的葡萄糖銨斜面培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。實(shí)驗(yàn)六 酪蛋白分解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解酪蛋白分解試驗(yàn)的用途及原理． (2)學(xué)習(xí)酪蛋白分解試驗(yàn)的操作技術(shù)． 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌則不具有。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗(yàn)菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，然后置37℃恒溫箱培養(yǎng)1—2d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗(yàn)陽(yáng)性。 (2)試劑 同氧化酶試驗(yàn)。 (2)學(xué)習(xí)淀粉水解試驗(yàn)的操作技術(shù)。 (3)試劑 路哥氏碘液(附錄1—3．2)‘ (4)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。2)學(xué)習(xí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。 (2)培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養(yǎng)基. (3)試劑 3%過(guò)氧化氫溶液． (4)其它 酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環(huán)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。3 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。1℃. 天平：. 均質(zhì)器。 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm PH計(jì)或PH比色管或精密PH試紙。4. 3 無(wú)菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。第一法 平板菌落計(jì)數(shù)法5 檢驗(yàn)程序 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1檢樣25g（或25 ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)~3個(gè)適宜樣品勻液，各取1ml分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15ml~20ml平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻 培 養(yǎng)36℃177。用1ml無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。同時(shí)分別取1ml稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿左空白對(duì)照。1℃培養(yǎng)48h177。3h. 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4ml），凝固后翻轉(zhuǎn)平板。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)（包括液體樣品原液）的平板均無(wú)菌落數(shù)生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。 若所有平板上蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。9 操作步驟 樣品的稀釋 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸( HCL ）調(diào)節(jié)pH 。每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。選取菌落數(shù)在30 300 之間的測(cè)試片計(jì)數(shù)