【正文】 ，選擇2個(gè)一3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，使用L形棒進(jìn)行表面涂布。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 無(wú)菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器及吸頭。與食品工業(yè)密切相關(guān)的乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等。 5. 4. 3如選擇API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5. 4. 1的初步判斷 結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂肁PI 20E生化鑒定 試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常。 其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門(mén)氏菌屬的可能，同時(shí)也均有不是沙門(mén)氏菌屬的可能。有些菌株形成灰綠色的菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變 HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色。1℃18h~24H36℃177。 3. 14 鄰硝基酚β－D半乳糖昔(ONPG)培養(yǎng)基:見(jiàn)第A. 13章。 3. 12 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基:見(jiàn)第A. 11章。 3. 3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見(jiàn)第A. 3章。 2. 1 冰箱:2℃~5℃ 2. 2 恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1℃,42℃士1℃ 2. 3 均質(zhì)器。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃~50℃傾注平板。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品以獲得更準(zhǔn)確的讀數(shù)。拿起壓板，靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。 及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。1℃培養(yǎng)48h177。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全程不過(guò)15min。 第一法 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)5 檢驗(yàn)程序 檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì) 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖110倍系列稀釋 選擇適宜三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管 36℃＋1℃ 48h177?；途G乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯：。 均質(zhì)器。該菌群主要來(lái)源于人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。如果液化現(xiàn)象干擾計(jì)數(shù)，可以計(jì)數(shù)未液化的面積來(lái)估算菌落數(shù)。 培養(yǎng)將測(cè)試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)。 若空白對(duì)照有菌落生成，則這次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。7 結(jié)果的表述 菌落總數(shù)的計(jì)算方法 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。 菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。及時(shí)將15ml~20ml冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃177。1℃48h177。 放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器或petrifilm自動(dòng)判讀儀。1℃，30℃177。四、方法與步驟從斜面挑取一環(huán)菌種置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過(guò)氧化氫溶液約2mL,觀察結(jié)果。 四，方法與步驟 將培養(yǎng)基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點(diǎn)種于平板上，每皿可點(diǎn)3—5個(gè)菌，37℃恒溫箱培養(yǎng)2—4d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果取培養(yǎng)好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪滿菌落周?chē)鸀槎?，平板呈藍(lán)色，而菌落周?chē)缬袩o(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉已被水解，稱淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性。四、方法與步驟 取37℃培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種試劑各2—3滴順斜面從上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培養(yǎng)物。具有酪蛋白分解酶的細(xì)菌在 蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周?chē)纬赏该魅Α?) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，無(wú)菌生理鹽水8mL(二支)．四、方法與步驟1） 做標(biāo)記 取葡萄糖銨培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面、無(wú)菌生理鹽水個(gè)2支，分別于其上做好培養(yǎng)基名稱和菌名等標(biāo)記。然后對(duì)應(yīng)地將菌種接入丙二酸鈉培養(yǎng)基試管中，連同空白對(duì)照置于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。四、方法與步驟將實(shí)驗(yàn)菌種首先制成懸液，以避免帶人少量碳源而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果．平板接種用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)基用直針接種．每一測(cè)定苗都必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。做這項(xiàng)測(cè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因酶的種類(lèi)而異．培養(yǎng)基可制成液體分裝試管，％一2％水洗瓊脂制成平板。實(shí)驗(yàn)七 β—半乳糖苷酶試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猞掳肴樘擒彰冈囼?yàn)的用途與原理：學(xué)習(xí)β半乳糖苷酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。 (2)培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 (2)培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。 (2)．接種培養(yǎng) 以無(wú)菌操作分別接種少量菌至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24℃ 48 h。(7) 同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對(duì)比。固定時(shí)通過(guò)火焰1—2次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。再按前所述，進(jìn)行分裝、加塞、包扎、 min。對(duì)微量成分FeSO4 (7) 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。2) 固體分裝：分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的1/5，滅菌后制成斜面。 pH不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。(2) 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。7H2O，F(xiàn)eS04所以每次配制培養(yǎng)基時(shí)，都要將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到一定的范圍。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用高氏I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。D. 從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距?？赏ㄟ^(guò)擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。4. 方法與步驟(1) 觀察前的準(zhǔn)備A. 置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約3—4cm。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來(lái)表示的。sin90176。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，與玻璃相同。(2) 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大1000—2 000多倍。sinα 式中 NA=數(shù)值孔徑； n=介質(zhì)折射率； α=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長(zhǎng)度成反比。例如用數(shù)值孔徑為1．25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的 因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=0．65），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0．42μm。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。(4) 油鏡觀察A. 用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類(lèi)微生物培養(yǎng)基的配制。在配制培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)各類(lèi)微生物的特點(diǎn)，就可以配制出適合不同種類(lèi)微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的培養(yǎng)基。7H2O FeSO4蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。(3) 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH。(5) 分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。因此棉塞質(zhì)量的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著很大的影響。(10) 無(wú)菌撿查將滅菌培養(yǎng)基放人37℃的溫室中培養(yǎng)24—48h，以檢查滅菌是否徹底。(2) pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。2. 基本原理 革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的重要性狀。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類(lèi)型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精。(6) 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。 (2)培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。實(shí)驗(yàn)五 甲基紅試驗(yàn)()一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理．學(xué)習(xí)甲基紅試驗(yàn)的操作技術(shù)。能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。在培養(yǎng)基中加入乙醚l~2ml，經(jīng)充分震蕩使吲哚萃取至乙醚中．靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試管中培養(yǎng)基顏色變黃者為該試驗(yàn)陽(yáng)性，記“十”號(hào)，否則記“一”。三，實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌()和枯草芽孢桿菌()。二、原理 由于微生物的酶系統(tǒng)不同，故有的菌能利用醋酸鹽作為氮源，有的菌則不能，當(dāng)醋酸鹽被分解利用后，培養(yǎng)基中產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基縣堿性，促使培養(yǎng)基中酸堿指示劑麝香草酚藍(lán)由綠色變成藍(lán)色，可利用此反應(yīng)來(lái)鑒別有關(guān)微生物。二、原理 有的菌種能利用銨鹽作為氮源而生長(zhǎng)，有的菌則不能用，在葡萄糖銨培養(yǎng)基中。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長(zhǎng)者為葡萄糖銨試驗(yàn)陽(yáng)性，記“十”號(hào)；不生長(zhǎng)或只生長(zhǎng)為極微小的菌落，而在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好者，為陰性，否則記“一”。組成這類(lèi)生物氧化體系的酶，主要是細(xì)胞色素類(lèi)酵。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色．三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。有的菌具有過(guò)氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶．故過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)是鑒別菌種的依據(jù)之一。 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1ml（或1g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。 無(wú)菌吸管：1ml（）、10 ml（）或微量移液器及吸頭。 1mol/L鹽酸（HCL）:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無(wú)菌吸管或吸頭。水產(chǎn)品30℃177。 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。 菌落總數(shù)的報(bào)告，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，揭開(kāi)上層膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 樣品勻液，垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動(dòng)上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。細(xì)菌濃度很高時(shí)，整個(gè)測(cè)試片會(huì)變成紅色或粉紅色，將結(jié)果記錄為“多不可計(jì)”。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類(lèi)食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。 恒溫水浴箱：46℃177。 pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。GB/－2008 無(wú)菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。 用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，巖管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。2h圖 2 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序GB/—20088 操作步驟 樣品的稀釋 。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)。 測(cè)定 樣品接種及培養(yǎng)將待檢樣品選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。2h 后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)或用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡或PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀來(lái)計(jì)數(shù)。報(bào)告單位以CFU/g（或CFU/mL）表示。 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn) 1. 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)方法。 2. 1 1 p H計(jì)或PH比色管或精密pH試紙。 3. 9 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑:見(jiàn)第A. 8章。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。 4檢驗(yàn)程序 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1 檢樣25g(ml)+225mlBPW=1ml+TTP 10ml1ml+SC 10mlBSXLD(或HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落TSI ，賴氨酸，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），靛基質(zhì)，尿素（PH ）,氰化鉀（KCN）商品化生化鑒定系統(tǒng)H2S+靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素KCN賴氨酸+H2S靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+/反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG沙門(mén)氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)非沙門(mén)氏菌報(bào)告36℃177。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~18 h 如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15 min，或2℃ ^}5℃不超過(guò)18 h解凍。+(一)多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性。5℃或室溫至少保留24 h，以備必要時(shí)復(fù)查。ONPG陰性為沙門(mén)氏菌，同時(shí)賴氨酸脫