【正文】 乳酸菌在MRS和MC培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征見(jiàn)表2。 :10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。圖 1 乳酸菌檢驗(yàn)程序圖7操作步驟。 ①由法國(guó)生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。 MRS（man rogosa sharpe）培養(yǎng)基：。 天平：。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。 GB/ 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)3 術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的固體、半固體和液體食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。 5. 4. 2. 4必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門(mén)氏菌生化群的鑒別。如有2項(xiàng)異常為非沙門(mén)氏菌 表4 沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7. 2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果 — — —甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） — + +沙門(mén)氏菌IV或V（要求符合本群生化特性） + — +沙門(mén)氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） +表示陽(yáng)性，—表示陰性。 表3沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)硫化氫(H, S)靛基質(zhì)pH7. 2尿素氰化鉀KCN賴氨酸脫羧酶A1+－－－+A2++－－+A3－－－+/－注：+陽(yáng)性；－陰性；+（－）陽(yáng)性或陰性 反應(yīng)序號(hào)A1典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。于3 6 ℃ 177。+/一陽(yáng)性或陰性。有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌落為紫紅色 5. 4. 1自選擇性瓊脂平板上分別挑取兩個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于 底層穿刺。 5. 2增菌 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物,移取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml TTB內(nèi)，于42℃士1℃培18 h~24 h 同時(shí)，另取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml SC內(nèi)，于36℃士1℃培養(yǎng)18 h ~24 h. 5. 3分離 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平 板或科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)。1℃40H~48H 5操作步驟 5. 1前增菌 稱取25 g(ml)樣品放人盛有225 ml BPW的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8 000 r/min^10 000 r/min均質(zhì) 1 min^－2 min，或置于盛有225 m工JBPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min^}2 min。1℃8h~18h42℃177。 3. 16 丙二酸鈉培養(yǎng)基:見(jiàn)第A. 15章。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。 3. 10尿素瓊脂(pH7. 2:見(jiàn)第A. 9章。 HE(Hektoen Enteric)瓊脂:見(jiàn)第A. 5章。 2. 12全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK)1) 3 培養(yǎng)基和試劑 3. 1 緩沖蛋白胨水(BPW):見(jiàn)第A. 1章。 2. 5 電子天平。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品和食物中毒樣品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)。 磷酸鹽緩沖液 成分磷酸二氫鉀（KH2PO4） 蒸餾水 500ml 制法貯存液：，用大約175ml的1mol/，用蒸餾水稀釋至1000ml后貯存于冰箱。 GB/T —2008附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 氯化鈉 乳糖 磷酸氫二鉀（K3HPO4） 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 月桂基磺酸鈉 蒸餾水 1000 ml177。如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15。紅色有氣泡的菌落確定認(rèn)為大腸菌群。1℃培養(yǎng)24h177。將PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下。例：104樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=105CFU/g（CFU/mL）。 證實(shí)試驗(yàn) 從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃177。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃177。 平板計(jì)數(shù) 選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群的MPN值。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從所有48h177。1℃培養(yǎng)24h177。 根據(jù)對(duì)樣品污染的狀況估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系稀釋樣品勻液。2h 產(chǎn)氣不產(chǎn)氣 大腸桿菌陽(yáng)性大腸桿菌陰性 查MPN表報(bào)告結(jié)果 圖1 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序6 操作步驟 樣品的稀釋 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1：10的樣品勻液。 1mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中。磷酸鹽緩沖液：。 菌落計(jì)數(shù)器或Pertrifilm 自動(dòng)判讀儀。 無(wú)菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器吸頭。1℃。3 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。2 術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15 min500mL 貯存液： g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中， mL的1 mol／1．氫氧化鈉溶，蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。 有時(shí)，當(dāng)細(xì)菌濃度很高時(shí)，測(cè)試片中央沒(méi)有可見(jiàn)菌落，但圓形培養(yǎng)膜的邊緣有許多小的菌落，其結(jié)果也記錄為“多不可計(jì)”；進(jìn)一步稀釋樣品可獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。 計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù)，可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養(yǎng)基凝固。第二法菌落總數(shù)Petrifilm TM測(cè)試片法8 檢驗(yàn)程序除將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM 菌落總數(shù)測(cè)試片外，其他與第5 章相同。 大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取用兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。示例： 稀釋度1；100（第一稀釋度）1；100（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35，則對(duì)所有稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。 選取菌落數(shù)在30CPU~300CPU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。1℃培養(yǎng)72h177。培養(yǎng) 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃177。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。 petrifilm菌落總數(shù)測(cè)試片和壓板。4. 2 磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)第A..2章。 無(wú)菌錐形瓶：容量250ml、500ml。 冰箱：2℃~5℃. 恒溫水浴箱：46℃177。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。 三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillus sp)。實(shí)驗(yàn)八 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)—，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的用途與原理。 (2)培養(yǎng)基 %的可溶性淀粉。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在兩分鐘內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽(yáng)性，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應(yīng)者均作為陰性結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)九 淀粉水解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解淀粉水解試驗(yàn)的原理及用途。這種酶在有分子氧與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對(duì)苯撐二胺和α—萘酚成吲哚酚藍(lán)，其反應(yīng)式同氧化酶試驗(yàn)．三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acill~subtilis)。(2) 培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板(附錄Ⅲ—19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。將觀察結(jié)果以表格方式記錄。要求每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20—100個(gè)為宜（或肉眼觀察不見(jiàn)渾濁）。磷酸二銨是唯一的氮源，故以能否在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)作為鑒別有關(guān)細(xì)菌的依據(jù)之一。將觀察結(jié)果以表格方式記錄。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)及沙門(mén)氏菌（Salmonella sp） (2)培養(yǎng)基 丙二酸鈉培養(yǎng)墓(附錄Ⅲ—6)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況明顯超過(guò)在空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量者為陽(yáng)性，否則為陰性。 (2)培養(yǎng)基 細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(附錄Ⅲ—5)。糖的含量一般為l％，醇類、％％，％。實(shí)驗(yàn)三 含碳化臺(tái)物的利用試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)會(huì)測(cè)定某菌能否利用某一含碳化合物的方法。當(dāng)試驗(yàn)產(chǎn)生β半乳糖苷酶時(shí)，鄰硝基酚βD半乳糖苷被水解，釋放出鄰硝基酚，此物為酸堿指示劑，(無(wú)色)→(黃色)，否則不變色。此時(shí)沿管璧緩慢加入5~10滴吲哚試劑(加人吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察)。四、方法與步驟標(biāo)記試管→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。吲哚本身沒(méi)有顏色，不能直接看看見(jiàn)，但當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，該試劑與吲哚作用．形成紅色的攻瑰吲哚。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 若培養(yǎng)液上層變成紅色, 即為陽(yáng)性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“+”或“”表示。二、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35 mL以上對(duì)應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入400 g／L氫氧化鈉溶液10~20滴，~1 mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶人，置37℃恒溫箱中保溫15℃ 30 min. b. 也可以取上述試管，加入和培養(yǎng)液一半的6%的萘酚，搖勻，再加入培養(yǎng)液1/3的40%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，觀察結(jié)果。四、方法與步驟發(fā)酵液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色?！?3) 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。 革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論針對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟、現(xiàn)象進(jìn)行討論。3．馬鈴薯培養(yǎng)基配制方法取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，放入1500mL的燒杯中煮沸30min，注意用玻棒攪拌以防糊底。／ml， g／m1的貯備液即可。2．高氏I號(hào)培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量和溶化 按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。3) 半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的l／4左右為宜。因