【正文】 4204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—— 注1：本表采用3個稀釋度〔（）、()〕〕,每個稀釋度接種3管 注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(或1ml)、()()時，表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍；()、()、()時，則表內(nèi)數(shù)字相應增高10倍，其余類推。 沙門氏菌檢驗 1. 范圍 本標準規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗方法。 本標準適用于各類食品和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢驗。 2設備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下。 2. 1 冰箱:2℃~5℃ 2. 2 恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1℃,42℃士1℃ 2. 3 均質(zhì)器。 2. 4 振蕩器。 2. 5 電子天平。感量0. 1 g 2. 6 無菌錐形瓶:容量500 ml,250 ml 2. 7 無菌吸管:1 ml(具0. 0lml，刻度),10 ml()或微量移液器及吸頭。 2. 8 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm 2. 9 無菌試管:3 mmX50 mm,10 mmX75 mm 2. 10 無菌毛細管。 2. 1 1 p H計或PH比色管或精密pH試紙。 2. 12全自動微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK)1) 3 培養(yǎng)基和試劑 3. 1 緩沖蛋白胨水(BPW):見第A. 1章。 3. 2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:。 3. 3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見第A. 3章。 3. 4 亞硫酸秘(BS)瓊脂:見第A. 4章。 HE(Hektoen Enteric)瓊脂:見第A. 5章。 3. 6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD)瓊脂:見第A. 6章。 3. 7 科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基z 3. 8 三糖鐵(TSI)瓊脂:見第A. 7章。 3. 9 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑:見第A. 8章。 3. 10尿素瓊脂(pH7. 2:見第A. 9章。 3. 1 1 氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基:。 3. 12 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基:見第A. 11章。 ⑴由法國生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 ⑵由法國科瑪嘉公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 GB/T －2008 3. 13 糖發(fā)酵管:見第A. 12章。 3. 14 鄰硝基酚β－D半乳糖昔(ONPG)培養(yǎng)基:見第A. 13章。 3. 15 半固體瓊脂:見第A. 1 4章。 3. 16 丙二酸鈉培養(yǎng)基:見第A. 15章。 3. 17 沙門氏菌O和H診斷血清。 3. 18 API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK GNI生化鑒定卡’。 4檢驗程序 沙門氏菌檢驗程序見圖1 檢樣25g(ml)+225mlBPW=1ml+TTP 10ml1ml+SC 10mlBSXLD(或HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落TSI ，賴氨酸，營養(yǎng)瓊脂（NA），靛基質(zhì)，尿素（PH ）,氰化鉀（KCN）商品化生化鑒定系統(tǒng)H2S+靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素KCN賴氨酸+H2S靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+/反應結果與左側(cè)描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG沙門氏菌，血清學試驗非沙門氏菌報告36℃177。1℃8h~18h42℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃40H~48H 5操作步驟 5. 1前增菌 稱取25 g(ml)樣品放人盛有225 ml BPW的無菌均質(zhì)杯中，以8 000 r/min^10 000 r/min均質(zhì) 1 min^－2 min，或置于盛有225 m工JBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min^}2 min。若樣品 為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需要，測定pH值，用1 mol/ml無菌氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至 6. 。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~18 h 如為冷凍產(chǎn)品，應在45℃以下不超過15 min，或2℃ ^}5℃不超過18 h解凍。 5. 2增菌 輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml TTB內(nèi)，于42℃士1℃培18 h~24 h 同時，另取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml SC內(nèi)，于36℃士1℃培養(yǎng)18 h ~24 h. 5. 3分離 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平 板或科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)。于36℃士1℃分別培養(yǎng)18 h~24 h (XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)或40 h~48 h (BS瓊脂平板)，觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上的菌落特 表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 選擇性瓊脂平板 沙門氏菌 BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色。有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變 HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色。有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色 XLD瓊脂 菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落。有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌落為紫紅色 5. 4. 1自選擇性瓊脂平板上分別挑取兩個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于 底層穿刺。接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃士1℃培養(yǎng) 18 h~24 h，必要時可延長至48 h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應 結果見表20 表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應結果 三糖鐵瓊脂賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫—++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬—++(一)+(一)_可疑沙門氏菌屬+++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬+++/一+/一_非沙門氏菌注:+陽性，一陰性。+(一)多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。+/一陽性或陰性。 GB/T －2008 表2說明，在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時賴氨酸脫梭酶試驗陰性的菌株可以排除。 其他的反應結果均有沙門氏菌屬的可能，同時也均有不是沙門氏菌屬的可能。 5. 4. 2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7. 2) ,氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于3 6 ℃ 177。1℃培養(yǎng)18 h~24 h，必要時可延長至48 h，按表3判定結果。將已挑菌落的平板儲存 于2℃177。5℃或室溫至少保留24 h，以備必要時復查。 表3沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫(H, S)靛基質(zhì)pH7. 2尿素氰化鉀KCN賴氨酸脫羧酶A1+－－－+A2++－－+A3－－－+/－注：+陽性；－陰性；+（－）陽性或陰性 反應序號A1典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素。氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常。按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌 表4 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表pH7. 2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結果 — — —甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果） — + +沙門氏菌IV或V（要求符合本群生化特性） + — +沙門氏菌個別變體（要求血清學鑒定結果） +表示陽性，—表示陰性。 5. 4. 2. 2 反應序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項試驗結果均為陽性，但需要結合血清學鑒定結果進行判定。 5. 4. 2. 3反應序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。 5. 4. 2. 4必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。 表5 沙門氏菌屬各生化群的鑒別項目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇++——+—山梨醇+++++—水楊苷———+——ONPG——+—+—丙二酸鹽—++———氰化鉀（KCN）———++— 注：+表示陽性—表示陰性。 5. 4. 3如選擇API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5. 4. 1的初步判斷 結果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙海褂肁PI 20E生化鑒定 試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。 GIi/T －2008食品中乳酸菌檢驗1 范圍 本標準規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗方法。 本標準適用于含活性乳酸菌的固體、半固體和液體食品中乳酸菌的檢驗。2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。 GB/ 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗3 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。 乳酸菌 lactic acid bacteria 一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。與食品工業(yè)密切相關的乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等。4 設備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下。 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。1℃。 冰箱：2℃～5℃。 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳體。 天平：。 無菌試管：18mm180mm、15mm100mm 。 無菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器及吸頭。 無菌錐形瓶：500mL、250mL、5 培養(yǎng)基和試劑 API 50CH生化鑒定試劑盒①。 MRS（man rogosa sharpe）培養(yǎng)基：。 MC（modified chalmers）培養(yǎng)基：。 %蔗糖發(fā)酵管：。 %纖維二糖發(fā)酵管：。 ①由法國生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 %麥芽糖發(fā)酵管：. %甘露醇發(fā)酵管：. %水楊苷發(fā)酵管：. %山梨醇發(fā)酵管：. %乳酸發(fā)酵管：. . 革蘭氏染色液:6 檢驗程序乳酸菌檢驗程序見圖1。圖 1 乳酸菌檢驗程序圖7操作步驟?！妗?℃條件下解凍，時間不超過18h，也可在溫度不超過45℃的條件下解凍，時間不超過15min。：以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min一10000r/min均質(zhì)1min—2min，制成l:10樣品勻液；或置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min—2min制成1：10的樣品勻液。：液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25mL放人裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液。 :10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。，選擇2個一3個連續(xù)的適宜稀釋度，使用L形棒進行表面涂布。根據(jù)樣品中所含乳酸菌的種類選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，見表1，每一種培養(yǎng)條件的每個稀釋度作兩個平皿。乳酸菌在MRS和MC培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)特征見表2。從樣品稀釋到平板涂布整個試驗過程要求在20min內(nèi)完成。表 1 乳酸菌計數(shù)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的選擇樣品中所含菌屬 MRS瓊脂平板，36℃土l℃，48hMC瓊脂平板，36℃