【正文】 多層紗布過濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。 對(duì)于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。(3) 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH。同時(shí)．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。實(shí)驗(yàn)步驟1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。7H2O，馬鈴薯，蔗糖等。3H2O，MgSO47H2O FeSO47H2O FeSO4牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方牛肉膏 g蛋白胨 NaCl 水 1000mLpH ~高氏I號(hào)培養(yǎng)基配方可溶性淀粉 20gNaCl KNO3 1gK2HPO4霉菌和酵母菌的pH偏酸；細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。在配制培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)各類微生物的特點(diǎn)，就可以配制出適合不同種類微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的培養(yǎng)基。瓊脂只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。另外還有固體、液體、加富、選擇、鑒別等培養(yǎng)基之分。各類微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類繁多。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物培養(yǎng)基的配制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 明確培養(yǎng)基的配制原理。5. 實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1) 分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的狀態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化，同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。G. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。F. 觀察完畢，上旋鏡筒。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。C. 從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。(4) 油鏡觀察A. 用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。(3) 高倍鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。(2) 低倍鏡觀察 檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。凡檢查染色標(biāo)本時(shí)，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。鏡檢者姿勢(shì)要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時(shí)睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。3. 材料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、微生物制片標(biāo)本等。例如用數(shù)值孔徑為1．25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的 因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=0．65），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0．42μm。而在0．42μm以下的兩點(diǎn)之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。 式中λ=光波波長(zhǎng)。因此，一個(gè)高的分辨力意味著一個(gè)小的可分辨距離，這兩個(gè)因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實(shí)際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長(zhǎng)度成反比。其半數(shù)的正弦為sin60176。=1，故以空氣為介質(zhì)時(shí)（n=1），數(shù)值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質(zhì)時(shí)，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。同時(shí)，α的理論限度為90176。sinα 式中 NA=數(shù)值孔徑； n=介質(zhì)折射率； α=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。 利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。使用時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大1000—2 000多倍。 油鏡物鏡的基本原理 微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10）、高倍物鏡（4mm，40—45）和油鏡（1．8 mm，95—100）三種。2. 基本原理顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。食品微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)劉后偉、林丹瓊、劉旭光適合專業(yè)：綠色食品加工專業(yè) 食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè) 農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)專業(yè)實(shí)訓(xùn)一 顯微鏡的操作與使用實(shí)驗(yàn)1: 顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法1. 目的要求(1) 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。(2) 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。223。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點(diǎn)上看得最清晰時(shí)，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時(shí)，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，與玻璃相同。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NA＝n 因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖Ⅲ5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。sin90176。如光線入射角為120176。=0．87，則： 以空氣為介質(zhì)時(shí)： NA=10．87=0．87 以水為介質(zhì)時(shí)： NA=1．330．87=1．15 以香柏油為介質(zhì)時(shí)： NA=1．520．87=1．32 顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長(zhǎng)越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的。 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L(zhǎng)度為0．55μm，假如數(shù)值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0．42μm。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=1．25），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出0．22μm間的距離。4. 方法與步驟(1) 觀察前的準(zhǔn)備A. 置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約3—4cm。B. 調(diào)節(jié)光源，對(duì)光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。 調(diào)節(jié)光源時(shí)，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺(tái)同樣高，否則使用油鏡時(shí)光線較暗。在對(duì)光時(shí)，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。可通過擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。 將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約 0．5cm處，由目鏡觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。然后由目鏡觀察，并仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。B. 在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。D. 從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。(2) 在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？(3) 用油鏡觀察時(shí)，為什么要在載玻片上滴加香柏油？實(shí)訓(xùn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌2. 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用高氏I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。在這些培養(yǎng)基中，就營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類。它在96℃以上熔化成液體，而在45℃左右開始凝固成固體。培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。所以每次配制培養(yǎng)基時(shí)，都要將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到一定的范圍。3H2O MgSO47H2O 瓊脂 15—25g水 1000mL pH ~馬鈴薯培養(yǎng)基配方馬鈴薯（去皮） 200g葡萄糖（或蔗糖） 20g瓊脂 15~25g水 1000ml自然pH察氏培養(yǎng)基配方蔗糖 30gNaNO3 2gK2HPO4 1gKCl MgSO47H2O 瓊脂 15~25g蒸餾水 1000ml自然pH實(shí)驗(yàn)及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO47H2O，F(xiàn)eS04試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH ~)，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。(2) 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影晌細(xì)菌生長(zhǎng)。反之，用mol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。 pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。一般無(wú)特殊要求的情況下可以省去（本實(shí)驗(yàn)勿需過濾）。1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的l／4左右為宜。2) 固體分裝：分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。3) 半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。(6) 加塞圖12 棉塞的制作培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養(yǎng)在里面的微生物能夠從外界源源不斷地獲得新鮮無(wú)菌空氣。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。 (7) 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(9) 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多〕，將試管口端捆在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)的一半為宜 。2．高氏I號(hào)培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量和溶化 按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。對(duì)微量成分FeSO4／ml， g／m1的貯備液即可。如要配制固體培養(yǎng)基，其溶化過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。3．馬鈴薯培養(yǎng)基配制方法取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，放入1500mL的燒杯中煮沸30min，注意用玻棒攪拌以防糊底。再按前所述，進(jìn)行分裝、加塞、包扎、 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論針對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟、現(xiàn)象進(jìn)行討論。9．細(xì)菌能在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)嗎?為了分離放線菌，你認(rèn)為應(yīng)該采取什么措施?實(shí)訓(xùn)三 革蘭氏染色法1. 目的要求了解革蘭氏染色的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們