【正文】 最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。7H2O。3H2O，MgSO4⑷鑒別培養(yǎng)基 是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使微生物培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。(3)選擇性培養(yǎng)基 是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢怼⒒瘜W(xué)抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。(2)液體培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三類。在天然有機物的基礎(chǔ)上適當(dāng)加入已知成分的無機鹽類，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分，如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不恒定，也難以確定，但配制方便，營養(yǎng)豐富，所以常被采用。 (2)天然培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強，但價格較貴，而且微生物在這類培養(yǎng)基中生長較慢。 (1)合成培養(yǎng)基?？梢愿鶕?jù)微生物種類和實驗?zāi)康牟煌殖扇舾深愋汀嶒炘恚号囵B(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。實驗報告：1．繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征2．說明觀察到的呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時間不同，對酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？分析其原因。C培養(yǎng)。(3)接種 用尖細(xì)的接種針挑取很少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋再瓊脂塊上。(2)瓊脂塊的制作 取已經(jīng)滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基6~7ml注入另一個滅菌平皿中，使之凝固成薄層。包扎后121176。蓋上蓋玻片，放置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡觀察。（二）霉菌觀察—碘液浸片的觀察(4) ，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。(1) %呂氏堿性美藍(lán)染色液，然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌放在染液中，混合均勻。 顯微鏡， 載玻片 ，蓋玻片，無菌吸管 ，平皿 ，載玻片， 蓋玻片， U型玻璃棒 ，解剖針 ，鑷子 ，50%乙醇 ，20%的甘油等。實驗器材： 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培養(yǎng)約2day 的麥芽汁斜面培養(yǎng)物，曲霉 (Aspergillus sp.) ，青霉 (Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培養(yǎng)25天的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物。 玻璃紙培養(yǎng)觀察法：霉菌的玻璃紙培養(yǎng)觀察方法與放線菌玻璃紙培養(yǎng)觀察方法相似。這中方法既可以保持霉菌自然生長狀態(tài)，還便于觀察不同發(fā)育時期的培養(yǎng)物。載玻片培養(yǎng)觀察法：用無菌操作將培養(yǎng)物瓊脂薄層放置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長。觀察霉菌的形態(tài)主要有三種方法，直接制片觀察法：是將培養(yǎng)物放置于乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液中，制成霉菌制片鏡檢，其制片的特點是：細(xì)胞不變形；具有防腐作用，不易干燥，能保存較長時間；能防止孢子飛散；染液的藍(lán)色能增強反差。霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的、而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。本實驗通過美藍(lán)染液水侵片來觀察酵母菌的形態(tài)和發(fā)芽生殖方式。實驗原理：酵母菌是不運動的單細(xì)胞真核微生物，其大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍。5．進(jìn)行革蘭氏染色時，為什么特別強調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題？6．革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎？乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色？7．你認(rèn)為革蘭氏染色中，哪一個步驟可以省去而不影響最終結(jié)果？在什么情況下可以采用？實驗二 根霉、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察實驗?zāi)康模?．觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進(jìn)行涂片染色，以證明你的染色結(jié)果正確性。實驗報告：1． 列表簡述3株細(xì)菌的染色觀察結(jié)果（說明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng)）。菌體被染成藍(lán)紫色是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。 5．復(fù)染用番紅染液復(fù)染約2min，水洗。 4．脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。 2．初染 滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色12min，水洗。實驗內(nèi)容：1．制片 取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。 2．染色劑 革蘭氏染色液。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，象簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色（紅色），該菌屬于革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。 2． 了解革蘭氏染色的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。目錄實驗一 細(xì)菌的革蘭氏染色………………………………………3 實驗二 根霉、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察…………………………4實驗三 培養(yǎng)基制備………………………………………………6實驗四 滅菌與消毒………………………………………………9實驗五 微生物的分離和純化……………………………………12實驗六 微生物的生理生化反應(yīng)…………………………………14實驗七 水中細(xì)菌總數(shù)的測定……………………………………19實驗八對實驗中所出現(xiàn)的一些現(xiàn)象多向?qū)W生提出問題，使它們學(xué)會分析結(jié)果，并與理論知識有機結(jié)合；3）根據(jù)實驗的進(jìn)行程度，引導(dǎo)學(xué)生更深入思考，逐步樹立他們的創(chuàng)新意思；4）嚴(yán)格要求使操作技能規(guī)范化，老師作示范，強調(diào)其要點學(xué)生自己練。以學(xué)生自己動手為主，老師在適當(dāng)時間予以提示；2)2. 教學(xué)方法1)二、教學(xué)要求與教學(xué)方法1. 教學(xué)要求1)提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力。因此，熟悉掌握微生物學(xué)方法與技術(shù)，對其它很多學(xué)科的發(fā)展有直接的影響。微生物學(xué)實驗指導(dǎo)書生物技術(shù)教學(xué)部 初立業(yè) 編重慶郵電學(xué)院生物信息學(xué)院2003年12月30日前言一、本課程的性質(zhì)和任務(wù)微生物學(xué)實驗是生物學(xué)重要的基礎(chǔ)課之一，特別是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展與拓寬，微生物學(xué)方法與技術(shù)顯得尤為重要。此外，醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、林學(xué)等學(xué)科，甚至地質(zhì)學(xué)、太空學(xué)等也需微生物的方法與技術(shù)。無菌操作技能和無菌概念的建立是微生物學(xué)實驗中最重要的內(nèi)容，微生物學(xué)實驗課主要任務(wù)是使學(xué)生掌握研究與應(yīng)用微生物的主要方法與技術(shù)，包括經(jīng)典的、常規(guī)的、以及現(xiàn)代的方法與技術(shù)，使學(xué)生具有適應(yīng)于從事相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)理論研究與實際生產(chǎn)應(yīng)用的微生物學(xué)實驗技能。與微生物學(xué)基礎(chǔ)理論課緊密結(jié)合，使學(xué)生將理性知識與感性認(rèn)識有機地結(jié)合，將書本知識用于實驗，在實驗中更深地理解基礎(chǔ)理論，提高學(xué)生的綜合能力與創(chuàng)新意識。根據(jù)本學(xué)科的特點，逐步使學(xué)生認(rèn)識微生物的基本特性，比較它們與其它生物的相似和不同之處，知道如何研究微生物以及對研究中所出現(xiàn)的問題點樣分析，并加以解決。 注重微生物學(xué)基礎(chǔ)實驗技能的掌握與提高，克服盲目追求新穎而忽視基礎(chǔ)的傾向；2)實驗課前要預(yù)習(xí)，明確每次實驗的目的與基本步驟；3) 在實驗中要有嚴(yán)緊的科學(xué)態(tài)度，尊重事實與實驗結(jié)果，要善于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象；4) 樹立密切合作的風(fēng)氣，包括學(xué)生與老師、班與班、組與組、組長與組員之間的密配合。三. 教學(xué)學(xué)時分配與安排本課程按每周3學(xué)時安排， 共6個實驗，總學(xué)時18。 放線菌形態(tài)的觀察………………………………………21實驗九 細(xì)菌的芽胞染色…………………………………………22實驗十 微生物菌種保藏…………………………………………24實驗一 細(xì)菌的革蘭氏染色法實驗?zāi)康模? 1． 學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。實驗原理： 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此基礎(chǔ)上作了某些改進(jìn)。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脫色，最后用復(fù)染劑（如番紅）復(fù)染。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。實驗器材： 1．菌種 大腸桿菌 (Escherichia coli) 約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）12～20h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。 3. 儀器或其它用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水。 *要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。 3．媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。 *革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間一般約2030s。 6．鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。7．混合涂片染色按上述方法，在同一載玻片上，以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌或大腸桿菌和金黃色葡萄菌作為混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。2．你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？3．現(xiàn)有一株細(xì)菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應(yīng)。4．你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請說明原因。 2．學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌的基本方法，了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。霉菌可產(chǎn)生分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，可用低倍顯微鏡觀察。必要時，還可用樹脂封固，制成永久標(biāo)本長期保存。培養(yǎng)一定時間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置顯微鏡下觀察。這種方法用于觀察不同生長階段霉菌的形態(tài)，也可獲得良好的效果。 %%呂氏堿性美藍(lán)染色液，革蘭氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。實驗內(nèi)容：（一）酵母觀察(2) 用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢地將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。 (3) 將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞。(5) %呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述操作。在載玻片中央加一小滴革蘭氏染色液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少許酵母菌苔放在水—碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。 在載玻片上加一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，用解剖針從霉菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)孢子的霉菌菌絲，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子，再放在載玻片上的染色液中，用解剖針小心地將菌絲分散開。(1)培養(yǎng)小室的滅菌 在平皿皿底鋪一張略少于皿底的圓濾紙片，再放一U型玻璃棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋。C滅菌30min，烘干備用。~1cm2的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上。(4)培養(yǎng) 先在平皿的濾紙上加3~5ml滅菌的20%甘油(用于保持平皿內(nèi)的濕度)，蓋上蓋，28176。(5)鏡檢 根據(jù)需要可以在不同的培養(yǎng)時間內(nèi)取出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡