【正文】 成洗滌劑*（含LAS者）：%；蛋白胨：%；NaCl：%；NH4NO3：%；KH2PO4：%；K2HPO4：%；蒸餾水：100ml。，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。*分別配制四種含不同LAS濃度的培養(yǎng)液，使其LAS含量為1180及240mg/L?？筛鶕?jù)所采用的洗滌劑型號中LAS含量換算，再經(jīng)實(shí)測（LAS測定見本實(shí)驗(yàn)“測定方法”項(xiàng)）。培養(yǎng)液分裝于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS濃度標(biāo)記清楚，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘備用。3．美藍(lán)溶液：稱取100 mg美藍(lán)溶于蒸餾水后稀釋至100ml。移取該液30ml于1000ml容量瓶中，加 NaH2PO42H2O, 用蒸餾水溶解后加入容量瓶并稀釋至1000ml刻度處。 4．LAS標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取純LAS (%LA S標(biāo)準(zhǔn)品可由上海有機(jī)化學(xué)研究所提供)，溶于蒸餾水，稀釋至500ml，此液LAS濃度為1mg/ml。取此液10ml稀釋至1000ml,。5．洗滌液： NaH2PO42H2O ,溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。6．恒溫振蕩器。7．分光光度計(jì)(具波長652nm)。8．離心機(jī)。9．500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脫脂棉等。四、方法和步驟 1．接種：取氣菌株斜面菌種1支，以10ml無菌水洗下菌苔，充分搖勻打散，制成濃菌液。每瓶培養(yǎng)液中接入菌液1ml；每種LAS濃度接2瓶，另設(shè)1瓶不接種作對照。2．培養(yǎng)：將接種與不接種之對照瓶置震蕩器上，控制轉(zhuǎn)速為170220r/min，于32177。1℃恒溫震蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)實(shí)時(shí),將培養(yǎng)液離心以除去菌體(8000r/min離心10分鐘或4000r/min離心30分鐘)。離心后之上清液留作測定LAS用。3．LAS測定：LAS和美藍(lán)可生成藍(lán)色化合物，并溶于氯仿等有機(jī)溶劑中。(1)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0、120 ml LAS標(biāo)準(zhǔn)液()分別稀釋至100 ml制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液100ml裝于250 m1分液漏斗中，用H2S04調(diào)節(jié)pH至微酸性，加美藍(lán)液25ml。① 氯仿提?。合蛏鲜龇忠郝┒分屑勇确?0ml，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層，將氯仿層排入另一個(gè)250m1分液漏斗中。如此提取三次。② 洗滌：在上述接納了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50ml洗滌液，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層。將一小塊脫脂棉塞入分液漏斗活塞下部以濾除水珠，分液漏斗中的氯仿層緩緩放下至一個(gè)50 ml容量瓶中。 ③ 再次提?。杭勇确?ml于上述②分液漏斗的水液中,振蕩分層后將氯仿層并入上述②容量瓶中。如此提取三次。然后用氯仿將容量瓶中液體稀釋至50 ml刻度處。④ 測定LAS：用純氯仿做空白對熙，用分光光度計(jì)固定波長為652nm，測定各標(biāo)準(zhǔn)液的光密度值(OD)。以光密度值作縱坐標(biāo)，LAS的毫克數(shù)(所取該液的ml數(shù))作橫坐標(biāo)，制取標(biāo)準(zhǔn)曲線。并通過圖解法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率K。(2)培養(yǎng)液測定：吸取離心后的培養(yǎng)液上清液110ml，放于250m1分液漏斗中，用蒸餾水稀釋至100ml。以下步驟同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的步驟，測得樣品的氯仿提取液之光密度值。按下式計(jì)算樣品中LAS濃度。LAS(mg/L)＝OD6521000/（標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率水樣體積）100%4．LAS降解度計(jì)算D＝（C0－Ct）/C0100%D：降解度%C0：振蕩培養(yǎng)開始時(shí)的起始LAS濃度(mg/L)Ct:：振蕩培養(yǎng)若干小時(shí)后的殘留LAS濃度(mg/L)如果未接菌液的空白對照液經(jīng)培養(yǎng)后，LAS也有所減少，且其差值為C(mg/L)，則D＝｛C0－(Ct+C)｝/C0100%五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及報(bào)告將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。表 LAS起始濃度對微生物降解度的影響起始LAS濃度（mg/L）40120180240接種不接種接種不接種接種不接種接種不接種培養(yǎng)后殘留LAS濃度降解度（%）六、思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了什么問題？參考本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一個(gè)污染物微生物降解實(shí)驗(yàn)（要求有污染物的測定方法）。實(shí)驗(yàn)六 雙歧桿菌酸口服液的發(fā)酵制備實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)分離和純化菌株的方法； 學(xué)習(xí)營養(yǎng)口服液的制作方法及過程；初步了解食品藥品生產(chǎn)時(shí)的管理規(guī)定和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。二、實(shí)驗(yàn)原理雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸球菌等對人體有明顯有營養(yǎng)保健作用，是微生態(tài)試劑的重要生產(chǎn)菌株。雙歧桿菌是一種厭氧菌和微好氧菌株，它對生存環(huán)境的要求非?？量蹋资苎?、水分、光線、保護(hù)基質(zhì)等條件的影響。微好氧菌株經(jīng)過馴化，能承受一定氧壓，既有利于生產(chǎn)，又能促進(jìn)正常菌群生長和繁殖。在西紅柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、雙歧桿菌生長因子和低聚糖等物質(zhì)，能選擇性增殖雙歧桿菌。乳酸桿菌和乳酸球菌產(chǎn)酸快，從而為雙歧桿菌提供較低的pH值環(huán)境，對它的生長繁殖有促進(jìn)作用，因此選擇乳酸桿菌和乳酸球菌作輔助發(fā)酵菌株。與此同時(shí)雙歧桿菌代謝后會產(chǎn)生醋酸及乳酸，使培養(yǎng)液呈酸性，雖能抑制有害菌的生殖，但如果pH值過分降低也使菌體其自身受到酸性的影響，因此在含活菌的活性營養(yǎng)口服液中大多添加磷酸鹽等緩沖物質(zhì)，防止pH過分偏低，延長產(chǎn)品中活菌的保持期并保持其保健作用。三、材料與方法(一) 實(shí)驗(yàn)材料菌種：雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌由本實(shí)驗(yàn)室篩選，經(jīng)權(quán)威部門鑒定符合生產(chǎn)和臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)基： 改良TJA培養(yǎng)基（培養(yǎng)雙歧桿菌用）：番茄汁50mL；酵母浸出物5g；肉膏l(xiāng)Og；乳糖20g；葡萄糖2g；K2HPO4 2g；Tween80 1g；；瓊脂15g。 BL培養(yǎng)基（培養(yǎng)乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白胨15g；酵母浸膏6g；肝浸液45 mL；葡萄糖20g；； NaCl5g；Tween80 3ml；LCys g；蒸餾水1000mL；。 去脂TJA培養(yǎng)基：在改良TJA培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上減去瓊脂。 發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)發(fā)酵液)：番茄汁1 ml；酵母浸出物1g；乳糖1g；葡萄糖1g；K2HPO4 ；Tween80 ；3%豆粕浸汁100ml。滅菌溫度在115℃，時(shí)間20min。青春型雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸球菌的發(fā)酵菌種：試管斜面—→轉(zhuǎn)種50 mL試管—→250mL三角瓶—→測定菌量、酸度和pH值。液體接種量為3%，搖床振蕩培養(yǎng)。(二) 實(shí)驗(yàn)方法菌株活化及發(fā)酵劑制作(1) 倒平板培養(yǎng)基：將改良TJA培養(yǎng)基完全融化并冷卻至45℃左右倒平板，冷凝待用。(2) 分離純化及活化: 用接種環(huán)分別在雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌斜面上挑取少許菌株作平板劃線分離。分離后，放37℃下培養(yǎng)以獲得單菌落。(3) 觀察菌落特征：經(jīng)23天培養(yǎng)，待菌落長成后，應(yīng)仔細(xì)觀察并區(qū)別不同類型的菌，注意是否有污染。青春型雙歧桿菌在培養(yǎng)基平板表面常呈現(xiàn)的形態(tài)菌落特征: 大小為23mm, 菌落中央呈隆起狀，邊緣整齊，半透明狀，有濃郁的醋酸味，染色鏡檢為短桿狀。乳酸菌在BL培養(yǎng)基平板表面常呈現(xiàn)三種形態(tài)特征的菌落: ①扁平型菌落:大小為23mm,邊緣不整齊，很薄，近似透明狀，染色鏡檢為桿狀；②半球狀隆起菌落:大小為12mm,隆起成半球狀，邊緣整齊且四周可見酪蛋白水解透明圈，染色鏡檢為鏈球狀；③禮帽形突起菌落:大小為12mm，邊緣基本整齊，菌落中央呈隆起狀，四周較薄，也有酪蛋白透明圈，染色鏡檢也呈鏈球狀。(4) 挑取少許具有上述菌落特征和菌株，分別接入裝有50ml去脂TJA培養(yǎng)基的試管中，37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁時(shí)停止作發(fā)酵劑用，如果需用量大可改用發(fā)酵罐培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng): 實(shí)驗(yàn)流程輔助原料 發(fā)酵劑 ↓ ↓豆粕煮汁—→調(diào)配—→灌裝—→高壓滅菌—→混合接種—→發(fā)酵—→成品 注意事項(xiàng)℃，時(shí)間為1h，不時(shí)的攪拌，以免糊化。煮汁一定要細(xì)過濾。 雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌的比例為：3:1:1，總接種量為3%?！妫?dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁沉淀時(shí)，表明此時(shí)活菌數(shù)很高且大量產(chǎn)酸()，即可終止發(fā)酵。 選擇優(yōu)良的發(fā)酵劑是產(chǎn)品是否具有保健作用的關(guān)鍵，也是產(chǎn)品能否長期保存期的關(guān)鍵。 輔助原料按發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)發(fā)酵液)配方配制，現(xiàn)配現(xiàn)用以防污染；在發(fā)酵及傳代中應(yīng)避免雜菌污染。 實(shí)際生產(chǎn)時(shí)應(yīng)按國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)組織生產(chǎn)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄將雙歧桿菌口服液混菌發(fā)酵液發(fā)酵結(jié)果記錄于下表中。沉淀情況活菌總數(shù)pH 值口感口服初步感覺六、思考題在制備保健口服液時(shí)，應(yīng)具備那些條件？在制備保健口服液時(shí)，應(yīng)注意那些因素?第四部分 主要參考書[1] 周群英，《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》第二版， 高等教育出版社 ,2001年。[2] 周德慶，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》第二版，高等教育出版社 ,2002年。[3] 沈萍，范秀容，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第三版， 高等教育出版社 ,2002年。[4] 黃秀梨，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，高等教育出版社 ,1999 年。[5] 趙斌，何紹江，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》，科學(xué)出版社 ,2002 年。20 /