【正文】 的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解微生物分離和純化的原理；掌握常用的分離純化微生物的方法；掌握菌落特征的觀察；學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)； 六、思考題 制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？ 做過本次實(shí)驗(yàn)后，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問題？ 滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義？ 試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。 用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120℃持續(xù)30分鐘即可。干燥箱滅菌 將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸。 滅菌前的準(zhǔn)備 玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。 干熱滅菌法 通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。 升壓、保壓和降壓：當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。 排氣：打開排氣口(也叫放氣閥)。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。 操作方法和注意事項(xiàng) 加水：打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。 高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。2 滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。 包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。 液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。 待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO瓊脂、NaNOKCl、MgSOFeSO蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計(jì)、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。三、實(shí)驗(yàn)材料 器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察? 7.不經(jīng)過復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌？ 5. 四、思考題1. 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ，繪出兩種細(xì)菌的形態(tài)圖。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G）。鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。 水洗，然后用吸水紙吸干。脫色時(shí)間一般約20～30s。 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。水洗。媒染用盧戈氏碘液媒染約l 初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于兩個(gè)玻片的涂面上，染色1～2min 常規(guī)涂片法 取一潔凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標(biāo)上菌號，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別挑取少量菌體涂片，干燥、固定。涂片 步驟 5 4染色劑 結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液。 coli）約24h營養(yǎng)瓊脂斜面菌種一支，枯草芽孢桿菌（Bacillus菌種 大腸桿菌（Escherichia材料 革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。實(shí)驗(yàn)原理 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色技術(shù)，鞏固學(xué)習(xí)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用方法。了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。 二、革蘭氏染色法 1 6鏡檢 涂片干后鏡檢。 水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。水洗 傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。 染色 將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。固定 如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時(shí)不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。涂片 取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸餾水)于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。步驟 流程 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。儀器或其他用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。 實(shí)驗(yàn)教師可根據(jù)具體情況提供合適的菌種。 3常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。 染色前必須固定細(xì)菌。常用作簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因?yàn)樵谥行?、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征，鞏固學(xué)習(xí)油鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。掌握細(xì)菌的簡單染色法。學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。實(shí)驗(yàn)二 微生物的染色及觀察實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、細(xì)菌的簡單染色法 1為什么在使用高倍鏡及油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器的誤操作？ 什么是物鏡的同焦現(xiàn)象？它在顯微鏡觀察中有什么意義？ 影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會，談?wù)剳?yīng)如何根據(jù)所觀察微生物的大小，選擇不同的物鏡進(jìn)行有效的觀察。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌及青霉的形態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化。（4） 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。 （3） 用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。3. 顯微鏡用畢后的處理 （1） 上升鏡筒，取下載玻片。 （4）活性污泥觀察 取一片干凈的載玻片放在實(shí)驗(yàn)臺上，用一支滴管吸取試管中藻類培養(yǎng)液于載玻片的中央，用干凈的蓋玻片覆蓋在液滴上(注意不要有氣泡)即成標(biāo)本片。遇此情況，應(yīng)重新操作。調(diào)節(jié)照明使視野亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。利用這種同焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時(shí)僅用細(xì)調(diào)節(jié)器即可對物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調(diào)節(jié)器時(shí)可能的誤操作而損壞鏡頭或載玻片。對聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動標(biāo)本仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。 在任何時(shí)候使用粗調(diào)節(jié)器聚焦物像時(shí)，必需養(yǎng)成先從側(cè)面注視小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀察，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)焦的習(xí)慣，以免因一時(shí)的誤操作而損壞鏡頭及玻片。下降 10