【正文】 溫箱培養(yǎng)。使用時(shí)將接種細(xì)菌的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學(xué)藥品的安瓿折斷，幾分鐘后再折斷裝有美藍(lán)的安瓿，若美藍(lán)為無色則表示袋內(nèi)已處于無氧狀態(tài)，置35℃溫箱孵育。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。2）氣體發(fā)生袋法（Gaspak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍(lán)和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉氯化鈷合劑、碳酸氫鈉檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時(shí)剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生H2和CO2。（750mmHg），再充入無氧氮?dú)猓磸?fù)三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無氧狀態(tài)，則指示劑美藍(lán)為無色。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。隨著缸內(nèi)蠟燭燃燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時(shí)缸內(nèi)的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。（2）燭缸法：取一有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)速度快，在孵育18~24h后即可見到生長(zhǎng)現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長(zhǎng)速度慢的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長(zhǎng)現(xiàn)象。三、細(xì)菌的培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法 該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。半固體培養(yǎng)基接種時(shí)注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。（5）平板劃線時(shí)注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40176。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時(shí)要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。操作時(shí)不宜說話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細(xì)菌污染培養(yǎng)基。2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個(gè)方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。（1）活菌計(jì)數(shù)：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細(xì)菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的純培養(yǎng)，以進(jìn)一步鑒定細(xì)菌或保存菌種。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。2）同上法將平板蓋打開約30~45176。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細(xì)菌污染。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線接種法該法可將標(biāo)本中的多種細(xì)菌分散成單個(gè)菌落，有利于細(xì)菌的分純和進(jìn)一步鑒定。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細(xì)菌的動(dòng)力或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開，試管口通過火焰燒灼滅菌。二、細(xì)菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。一般要求接種環(huán)長(zhǎng)5~8cm，直徑為2~4mm。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機(jī)、記號(hào)筆等?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。2．掌握細(xì)菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。（4）在加熱溶化時(shí)注意溶液不能溢出瓶外，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個(gè)雞蛋的卵蛋白加水20ml，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸汽加熱30~60min，使培養(yǎng)基中的不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或?yàn)V紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進(jìn)入培養(yǎng)基中，；。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過久。（7）鑒定 包括兩項(xiàng)內(nèi)容：1）無菌試驗(yàn)：將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長(zhǎng)為合格。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質(zhì)配制的培養(yǎng)基滅菌。（6）滅菌 根據(jù)培養(yǎng)基的成分、性質(zhì)采用不同的滅菌方法。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在傾注平板前應(yīng)冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝于無菌平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿分裝量約13~15ml），待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉(zhuǎn)，即為瓊脂平板。（5）分裝　根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進(jìn)行包扎。（4）過濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過濾。計(jì)算：，現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。將4支試管按圖31所示插入比色架中進(jìn)行比色。比色法：取3支與標(biāo)準(zhǔn)管口徑相同的試管，按下表加樣。（3）矯正PH：用PH比色計(jì)、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH，~。（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。其他培養(yǎng)基大多是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抑菌劑、檢測(cè)基質(zhì)、指示劑等）配制而成。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。在使用前不能隨意打開，一經(jīng)打開則不再認(rèn)為是無菌的。如用干烤法應(yīng)注意控制溫度和時(shí)間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應(yīng)直立并扎成捆，以免滅菌時(shí)傾倒。2．常用無菌器材的準(zhǔn)備（1）包裝1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內(nèi)。在消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時(shí)有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3~5％的來蘇液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時(shí)，最后用自來水洗凈，晾干備用。 2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時(shí)，再用自來水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內(nèi)數(shù)小時(shí)，將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來水反復(fù)沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、常用玻璃器材的洗滌和準(zhǔn)備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化學(xué)物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長(zhǎng)；試管不清潔也可影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，如在pH3時(shí)可發(fā)生酸凝集?！驹噭┡c器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。2．熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。無鞭毛細(xì)菌不能做真正的運(yùn)動(dòng)，但受水分子的撞擊而呈分子運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），即在一定范圍內(nèi)作來回顫動(dòng)，位置移動(dòng)不大，注意與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)相鑒別。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動(dòng)。2．懸滴法取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。因此，不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力，常用的方法有以下幾種。結(jié)果：菌體染成藍(lán)綠色，異染顆粒染成藍(lán)黑色。結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍(lán)色。3），水洗。（2）密爾氏法1）涂片：，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加熱固定。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。4．莢膜染色法（1）黑斯氏法1）涂片，自然干燥，加熱固定。3）復(fù)染：用堿性美藍(lán)染1min，水洗，待干、鏡檢。1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過程中應(yīng)隨時(shí)添加染液，冷卻后水洗。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。觀察時(shí)應(yīng)從細(xì)菌較少的地方尋找鞭毛。（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10~15min后，將玻片微傾斜，用蒸餾水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。（2）在玻片上加蒸餾水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在蒸餾水滴的頂部（一般只需點(diǎn)一下，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時(shí)從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。2．鞭毛染色法（改良Ryu法）鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意動(dòng)作盡量輕，以免鞭毛脫落。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。1．細(xì)胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。5．醫(yī)學(xué)意義：通過革蘭染色有助于細(xì)菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細(xì)菌的致病性。（4）所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會(huì)降低染液濃度，影響染色效果。（2）脫色時(shí)間長(zhǎng)短要適宜，如果涂片較厚應(yīng)相應(yīng)的延長(zhǎng)脫色時(shí)間，如涂片較薄則相應(yīng)的縮短脫色時(shí)間，脫色時(shí)應(yīng)不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可。4．注意事項(xiàng)：（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過字跡為宜（半透明）。固定的目的在于殺死細(xì)菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著色。（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠(yuǎn)處微微加熱烘干，但切勿靠近火焰。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。（3）通透性學(xué)說：革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫色時(shí)，乙醇不易進(jìn)入，而且95％乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點(diǎn)學(xué)說：革蘭陽性菌的等電點(diǎn)（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。單染法是用一種染料去染，所有細(xì)菌都染成一種顏色；復(fù)染法是用多種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，不同細(xì)菌可染成不同的顏色。3．其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。3．熟悉不染色標(biāo)本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。【結(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查【目的和要求】1．熟悉細(xì)菌染色的常用染料和一般程序。3．注意事項(xiàng)（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時(shí)一經(jīng)開啟不宜中斷，斷電后需待汞燈冷卻后（約15min）方能再啟用。（2）裝好配對(duì)的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。（2）濾光片：1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標(biāo)本和保護(hù)眼睛。（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺(tái)上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學(xué)顯微鏡。2．使用方法：