【正文】 【目的和要求】1．掌握細(xì)菌生化反應(yīng)的概念。2．半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：（1）無鞭毛的細(xì)菌：僅沿穿刺線生長，穿刺線清晰，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球菌）。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。大多數(shù)細(xì)菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長速度慢的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。（5）平板劃線時注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40176。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計數(shù)。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細(xì)菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。二、細(xì)菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因為價格昂貴而限制了其應(yīng)用。（4）在加熱溶化時注意溶液不能溢出瓶外，否則會影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。（7）鑒定 包括兩項內(nèi)容：1）無菌試驗：將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長為合格。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。計算：，現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。如用干烤法應(yīng)注意控制溫度和時間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。在消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器?！緦?shí)驗內(nèi)容】一、常用玻璃器材的洗滌和準(zhǔn)備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，常可影響實(shí)驗結(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化學(xué)物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，如在pH3時可發(fā)生酸凝集。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動。結(jié)果：菌體染成藍(lán)綠色，異染顆粒染成藍(lán)黑色。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。5．醫(yī)學(xué)意義：通過革蘭染色有助于細(xì)菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細(xì)菌的致病性。固定的目的在于殺死細(xì)菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對染料的通透性，使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著色。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點(diǎn)學(xué)說：革蘭陽性菌的等電點(diǎn)（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。3．熟悉不染色標(biāo)本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。（2）濾光片：1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標(biāo)本和保護(hù)眼睛。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。（3）避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氯仿、乙醚、酒精等化學(xué)藥品與顯微鏡接觸，避免日光直射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標(biāo)本置載物臺上，用彈簧夾和推進(jìn)器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺至不能升高為止。（2）高倍鏡：鏡頭標(biāo)志為40或40/，鏡頭較長，其上?？逃兴{(lán)色環(huán)圈。2．掌握細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。建立健全了各項生物安全制度，還應(yīng)成立生物安全管理領(lǐng)導(dǎo)小組，加強(qiáng)生物安全制度實(shí)施情況的監(jiān)督管理，實(shí)驗室入口處須粘貼生物安全標(biāo)志，注明危險因素，生物安全級別，負(fù)責(zé)人姓名和電話，進(jìn)入實(shí)驗室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進(jìn)入實(shí)驗室，如需參觀實(shí)驗室等特殊行為需經(jīng)實(shí)驗室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)后方可進(jìn)入。（6）實(shí)驗室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免反光和強(qiáng)光。四級生物安全防護(hù)實(shí)驗室（BSL4）適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。三、生物安全防護(hù)知識簡介醫(yī)學(xué)檢驗工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標(biāo)本，這些標(biāo)本往往是各種細(xì)菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實(shí)驗人員感染，還是造成實(shí)驗室和周圍環(huán)境的污染，都將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)標(biāo)記清楚后送到指定地點(diǎn)。（1）試驗前須預(yù)習(xí)實(shí)驗內(nèi)容，了解實(shí)驗?zāi)康摹⒎椒ê妥⒁馐马?，做到心中有?shù)，避免發(fā)生錯誤，提高實(shí)驗效率。2．在微生物學(xué)實(shí)驗過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術(shù)。（4）實(shí)驗室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實(shí)驗室的安靜、整潔和有序。2．實(shí)驗室意外的緊急處理方法（1）發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進(jìn)行消毒，立即進(jìn)行醫(yī)療處理?；谝陨蟿澐謽?biāo)準(zhǔn)，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預(yù)防和治療措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關(guān)實(shí)驗活動需要達(dá)到的生物安全實(shí)驗室級別做了詳細(xì)分類，各實(shí)驗室進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗均需參照此標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《實(shí)驗室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則》，二級生物安全實(shí)驗室結(jié)構(gòu)設(shè)施需符合以下幾點(diǎn)：（1）實(shí)驗室需具有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進(jìn)入的設(shè)計，有可開啟的窗戶，有紗窗，實(shí)驗室門有可視窗帶鎖并能自動關(guān)閉。（8）有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)施，如高壓蒸汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置、應(yīng)急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等。因此，實(shí)驗室人員必須提高生物安全意識，認(rèn)真學(xué)習(xí)生物安全相關(guān)的各種法規(guī)和文件，定期進(jìn)行生物安全防護(hù)知識培訓(xùn)，熟悉生物防護(hù)有關(guān)知識，加強(qiáng)基本技能的培養(yǎng)，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。2．器材及其他：光學(xué)顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=），則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野光亮度增強(qiáng)，物象清晰（見圖12）。鏡檢時應(yīng)將標(biāo)本按一定方向呈“弓”形移動，直至整個標(biāo)本觀察完畢，以防漏檢。（5）細(xì)調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細(xì)而脆弱的部分，不要向一個方向連續(xù)轉(zhuǎn)動數(shù)周，應(yīng)輕微地來回旋轉(zhuǎn)。正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。操作同光學(xué)顯微鏡。2．試劑：革蘭染色液、細(xì)胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。 而革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易被溶出而脫色。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定標(biāo)本15min，水洗。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。2）脫色：用95%乙醇脫色1～2min，水洗。2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色1min，水洗。1．壓滴法用接種環(huán)分別取菌液2～3環(huán)，置于潔凈載玻片中央。【結(jié)果記錄和報告】實(shí)驗三 滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準(zhǔn)備。（2）用過的玻璃器材：1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應(yīng)先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌，然后趁熱倒出培養(yǎng)基，用5％肥皂水刷洗，再用自來水沖凈后倒置架上，晾干備用。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。二、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序和方法培養(yǎng)基是用人工方法將細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH比色計和比色法測定PH較為準(zhǔn)確，后者無需特殊儀器。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。2．常用培養(yǎng)基的配制和用途（見附錄一）3．培養(yǎng)基配制的注意事項（1）在進(jìn)行調(diào)配時應(yīng)在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分粘附在瓶壁上。3．熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法。圖41 接種環(huán)和接種針 接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。方法：（1）連續(xù)劃線法（圖44）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。圖46 斜面培養(yǎng)基接種法5．涂布接種法本法主要用于活菌計數(shù)和藥敏試驗。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)：1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFU稀釋倍數(shù)7．細(xì)菌接種的注意事項（1）細(xì)菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要求進(jìn)行。（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標(biāo)記再放置溫箱孵育。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍(lán)。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。3．固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：菌落：由一個細(xì)菌生長繁殖而形成的一個肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)?！驹噭┡c器材】1．菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無氣泡。4）~。故在培養(yǎng)基中加入含胍基的化合物（如肌酸或肌酐等），可加速該反應(yīng)。（3）結(jié)果觀察：液面的試劑變紅色為試驗陽性，黃色為陰性。最終有碳酸鈉和氨（NH3）產(chǎn)生，使培養(yǎng)基變堿，使其中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由淡綠色變成深藍(lán)色。 （3）結(jié)果觀察：于30秒內(nèi)有大量氣泡出現(xiàn)者為試驗陽性，無氣泡者為陰性。（3）結(jié)果觀察：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色者為陽性?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：普通平板（或血平板）、肉湯培養(yǎng)基。3）趁熱（不燙手為宜），傾注約15ml的普通瓊脂，立即在臺面上輕輕轉(zhuǎn)動平皿使其混勻。（2）結(jié)果觀察：拿出平板，觀察有無細(xì)菌生長，并紀(jì)錄結(jié)果。（3）將各管置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。（4）應(yīng)用：金屬器械、玻璃器皿、石膏等不易燃燒的物品。然后蓋嚴(yán)鍋蓋，以對角的順序均勻擰緊鍋蓋上的旋鈕之后，檢查關(guān)閉鍋蓋上的氣閥和所有開關(guān)。2）無菌包不宜過大，物品不宜放得過滿過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。苯甲酸的熔點(diǎn)為121~123℃，滅菌后看到苯甲酸粉末變成液態(tài)，冷卻后成固體，表示已達(dá)到滅菌的目的。5．紫外線消毒試驗 （1）工作原理：細(xì)菌的DNA可以吸收紫外線，使一條DNA鏈上的兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合形成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡和變異。返回時，應(yīng)先管好燈，避免長時間暴露在紫外燈下工作，紫外線對眼睛和皮膚均有損傷。2．抗菌藥物紙片：~，含有一定量的某種抗菌藥物?！緦?shí)驗內(nèi)容】一、 紙片擴(kuò)散法（KB法）藥敏試驗1．原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測細(xì)菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿紙片周圍由高濃度向低濃度擴(kuò)散，形成逐漸減少的梯度濃度。（4）貼紙片 用無菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細(xì)菌的瓊脂表面，每個平板可貼4~6種藥物紙片。（2）藥物紙片的貼放要均勻，并且要充分接觸瓊脂。（5）試驗過程嚴(yán)格按要求操作，嚴(yán)格無菌操作。原液以過濾法除菌，小量分裝使用，放20℃以下一般可保存三個月，如果置4℃只能保存一周。，經(jīng)35℃培養(yǎng)過夜后，%的種入菌的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。如果標(biāo)準(zhǔn)菌株的試驗結(jié)果超過或低于預(yù)期值一個稀釋度以上，不應(yīng)發(fā)出臨床報告，而應(yīng)找出差錯的原因。因此，開展對MRSA的檢測，對于控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行，指導(dǎo)臨床治療有著十分重要的意義。2）培養(yǎng)溫度應(yīng)為33~35℃，超過35℃耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長而漏檢。4）質(zhì)量控制：以大腸埃希菌ATCC2