【正文】 【目的和要求】1．掌握細菌生化反應(yīng)的概念。2．半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：（1）無鞭毛的細菌：僅沿穿刺線生長，穿刺線清晰，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球菌）。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內(nèi)進行操作。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。大多數(shù)細菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現(xiàn)象，但若標本中的菌量少或生長速度慢的細菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。（5）平板劃線時注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40176。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標本或樣品中活菌計數(shù)。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。4）在平板底上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。二、細菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細菌的增菌培養(yǎng)或進行細菌的生化反應(yīng)。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因為價格昂貴而限制了其應(yīng)用。（4）在加熱溶化時注意溶液不能溢出瓶外，否則會影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應(yīng)補足失去的水分。（7）鑒定 包括兩項內(nèi)容：1）無菌試驗：將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長為合格。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。計算：，現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。如用干烤法應(yīng)注意控制溫度和時間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。在消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。【實驗內(nèi)容】一、常用玻璃器材的洗滌和準備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣嶒灲Y(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化學物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學反應(yīng)的結(jié)果，如在pH3時可發(fā)生酸凝集。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細菌運動活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動。結(jié)果：菌體染成藍綠色，異染顆粒染成藍黑色。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。5．醫(yī)學意義：通過革蘭染色有助于細菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細菌的致病性。固定的目的在于殺死細菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細胞質(zhì)，改變細菌對染料的通透性，使細菌易與染料結(jié)合而著色。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點學說：革蘭陽性菌的等電點（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。3．熟悉不染色標本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。（2）濾光片：1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標本和保護眼睛。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。（3）避免強酸、強堿、氯仿、乙醚、酒精等化學藥品與顯微鏡接觸，避免日光直射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標本置載物臺上，用彈簧夾和推進器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺至不能升高為止。（2）高倍鏡：鏡頭標志為40或40/，鏡頭較長，其上?？逃兴{色環(huán)圈。2．掌握細菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。建立健全了各項生物安全制度，還應(yīng)成立生物安全管理領(lǐng)導小組，加強生物安全制度實施情況的監(jiān)督管理，實驗室入口處須粘貼生物安全標志，注明危險因素，生物安全級別，負責人姓名和電話，進入實驗室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進入實驗室，如需參觀實驗室等特殊行為需經(jīng)實驗室負責人的批準后方可進入。（6）實驗室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免反光和強光。四級生物安全防護實驗室（BSL4）適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。三、生物安全防護知識簡介醫(yī)學檢驗工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標本，這些標本往往是各種細菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實驗人員感染，還是造成實驗室和周圍環(huán)境的污染，都將導致嚴重的后果。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)標記清楚后送到指定地點。（1）試驗前須預(yù)習實驗內(nèi)容，了解實驗?zāi)康?、方法和注意事項，做到心中有?shù)，避免發(fā)生錯誤，提高實驗效率。2．在微生物學實驗過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術(shù)。（4）實驗室內(nèi)不準大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實驗室的安靜、整潔和有序。2．實驗室意外的緊急處理方法（1）發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進行消毒，立即進行醫(yī)療處理?；谝陨蟿澐謽藴?，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預(yù)防和治療措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關(guān)實驗活動需要達到的生物安全實驗室級別做了詳細分類，各實驗室進行有關(guān)實驗均需參照此標準。根據(jù)《實驗室生物安全認可準則》，二級生物安全實驗室結(jié)構(gòu)設(shè)施需符合以下幾點：（1）實驗室需具有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設(shè)計，有可開啟的窗戶，有紗窗，實驗室門有可視窗帶鎖并能自動關(guān)閉。（8）有適當?shù)南驹O(shè)施，如高壓蒸汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置、應(yīng)急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等。因此，實驗室人員必須提高生物安全意識，認真學習生物安全相關(guān)的各種法規(guī)和文件，定期進行生物安全防護知識培訓，熟悉生物防護有關(guān)知識，加強基本技能的培養(yǎng)，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程。2．器材及其他：光學顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=），則使進入油鏡的光線增多，視野光亮度增強，物象清晰（見圖12）。鏡檢時應(yīng)將標本按一定方向呈“弓”形移動，直至整個標本觀察完畢，以防漏檢。（5）細調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細而脆弱的部分，不要向一個方向連續(xù)轉(zhuǎn)動數(shù)周，應(yīng)輕微地來回旋轉(zhuǎn)。正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。操作同光學顯微鏡。2．試劑：革蘭染色液、細胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。 而革蘭陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易被溶出而脫色。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定標本15min，水洗。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。2）脫色：用95%乙醇脫色1～2min，水洗。2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色1min，水洗。1．壓滴法用接種環(huán)分別取菌液2～3環(huán)，置于潔凈載玻片中央?！窘Y(jié)果記錄和報告】實驗三 滅菌前的準備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準備。（2）用過的玻璃器材：1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應(yīng)先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌，然后趁熱倒出培養(yǎng)基，用5％肥皂水刷洗，再用自來水沖凈后倒置架上，晾干備用。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。二、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序和方法培養(yǎng)基是用人工方法將細菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH比色計和比色法測定PH較為準確，后者無需特殊儀器。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。2．常用培養(yǎng)基的配制和用途（見附錄一）3．培養(yǎng)基配制的注意事項（1）在進行調(diào)配時應(yīng)在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分粘附在瓶壁上。3．熟悉細菌生長現(xiàn)象的觀察方法。圖41 接種環(huán)和接種針 接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細菌均勻分布于培養(yǎng)基中。方法：（1）連續(xù)劃線法（圖44）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。角，將已挑取細菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。圖46 斜面培養(yǎng)基接種法5．涂布接種法本法主要用于活菌計數(shù)和藥敏試驗。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標本中的細菌數(shù)：1ml標本中的活菌數(shù)=全平板CFU稀釋倍數(shù)7．細菌接種的注意事項（1）細菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴格按要求進行。（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標記再放置溫箱孵育。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點燃的蠟燭，加蓋密封。1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。3．固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：菌落：由一個細菌生長繁殖而形成的一個肉眼可見的細菌集團?！驹噭┡c器材】1．菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無氣泡。4）~。故在培養(yǎng)基中加入含胍基的化合物（如肌酸或肌酐等），可加速該反應(yīng)。（3）結(jié)果觀察：液面的試劑變紅色為試驗陽性，黃色為陰性。最終有碳酸鈉和氨（NH3）產(chǎn)生，使培養(yǎng)基變堿，使其中的溴麝香草酚藍指示劑由淡綠色變成深藍色。 （3）結(jié)果觀察：于30秒內(nèi)有大量氣泡出現(xiàn)者為試驗陽性，無氣泡者為陰性。（3）結(jié)果觀察：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色者為陽性?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：普通平板（或血平板）、肉湯培養(yǎng)基。3）趁熱（不燙手為宜），傾注約15ml的普通瓊脂，立即在臺面上輕輕轉(zhuǎn)動平皿使其混勻。（2）結(jié)果觀察：拿出平板，觀察有無細菌生長，并紀錄結(jié)果。（3）將各管置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。（4）應(yīng)用：金屬器械、玻璃器皿、石膏等不易燃燒的物品。然后蓋嚴鍋蓋，以對角的順序均勻擰緊鍋蓋上的旋鈕之后，檢查關(guān)閉鍋蓋上的氣閥和所有開關(guān)。2）無菌包不宜過大，物品不宜放得過滿過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。苯甲酸的熔點為121~123℃，滅菌后看到苯甲酸粉末變成液態(tài)，冷卻后成固體，表示已達到滅菌的目的。5．紫外線消毒試驗 （1）工作原理：細菌的DNA可以吸收紫外線，使一條DNA鏈上的兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合形成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導致細菌的死亡和變異。返回時，應(yīng)先管好燈，避免長時間暴露在紫外燈下工作，紫外線對眼睛和皮膚均有損傷。2．抗菌藥物紙片：~，含有一定量的某種抗菌藥物?！緦嶒瀮?nèi)容】一、 紙片擴散法（KB法）藥敏試驗1．原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測細菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿紙片周圍由高濃度向低濃度擴散，形成逐漸減少的梯度濃度。（4）貼紙片 用無菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細菌的瓊脂表面，每個平板可貼4~6種藥物紙片。（2）藥物紙片的貼放要均勻，并且要充分接觸瓊脂。（5）試驗過程嚴格按要求操作，嚴格無菌操作。原液以過濾法除菌，小量分裝使用，放20℃以下一般可保存三個月，如果置4℃只能保存一周。，經(jīng)35℃培養(yǎng)過夜后，%的種入菌的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。如果標準菌株的試驗結(jié)果超過或低于預(yù)期值一個稀釋度以上，不應(yīng)發(fā)出臨床報告，而應(yīng)找出差錯的原因。因此，開展對MRSA的檢測，對于控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行，指導臨床治療有著十分重要的意義。2）培養(yǎng)溫度應(yīng)為33~35℃，超過35℃耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長而漏檢。4）質(zhì)量控制：以大腸埃希菌ATCC2