【正文】 面滴上香柏油（或水），再將標(biāo)本夾在移動尺上。四、熒光顯微鏡1．構(gòu)造：（1）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用150~200瓦高壓汞燈。2．熒光顯微鏡的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度（約5~10min）后，對準(zhǔn)光軸。操作同光學(xué)顯微鏡。（2）使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本時間不宜太長．因標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，即有熒光減弱現(xiàn)象。2．掌握革蘭染色的方法、原理、結(jié)果觀察及意義。4．熟悉細(xì)菌的特殊染色法。2．試劑：革蘭染色液、細(xì)胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌染色的一般程序細(xì)菌染色法分單染法和復(fù)染法。大部分細(xì)菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的染色方法，在實(shí)際工作中，應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色法。（2）化學(xué)學(xué)說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色。 而革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易被溶出而脫色。用接種環(huán)先挑取生理鹽水1~2環(huán)于載玻片每格中央，再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻。（3）固定：干燥后的標(biāo)本片在酒精燈火焰上來回通過3次（以鐘擺的速度），冷卻后染色。（4）染色：分以下四步：1min，水洗 1min，水洗 ，水洗 ，水洗結(jié)晶紫 盧戈碘液 95％乙醇 稀釋石炭酸復(fù)紅 待干、鏡檢（初染） （媒染） （脫色） （復(fù)染）3．結(jié)果：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。（3）水洗時，水流不能過大，防止水流直接對準(zhǔn)菌膜沖洗。（5）因細(xì)菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異，一般以18~24h培養(yǎng)物染色結(jié)果最好。三、特殊染色法細(xì)菌的細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色。（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定標(biāo)本15min，水洗。結(jié)果：有細(xì)胞壁的細(xì)菌僅菌體周邊染成紫色，菌體內(nèi)部無色；無細(xì)胞壁的細(xì)菌（如L型細(xì)菌）整個菌體都染成紫色。培養(yǎng)基應(yīng)為營養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營養(yǎng)瓊脂），不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國藍(lán)、MAC等）。若水滴向周圍流散而不形成水珠表示玻片處理良好。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。（5）玻片自然干燥后鏡檢。結(jié)果：鞭毛染成紅色。（2）染色：分為以下三步。2）脫色：用95%乙醇脫色1～2min，水洗。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞染成紅色。2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。結(jié)果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無色。2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色1min，水洗。4）加堿性美藍(lán)染色1min，水洗，待干，鏡檢。5．異染顆粒染色細(xì)菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見附錄二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、鏡檢。四、不染色標(biāo)本檢查法細(xì)菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點(diǎn)，不能判斷細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。1．壓滴法用接種環(huán)分別取菌液2～3環(huán)，置于潔凈載玻片中央。先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細(xì)菌的運(yùn)動。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片凹窩對準(zhǔn)蓋玻片上的菌液，迅速翻轉(zhuǎn)載玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊封閉（見圖21），置顯微鏡下觀察。觀察要點(diǎn)：有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動活潑，可向不同方向迅速運(yùn)動，位置移動明顯?！窘Y(jié)果記錄和報告】實(shí)驗(yàn)三 滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準(zhǔn)備。3．掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項(xiàng)。2．器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙等。因此，微生物實(shí)驗(yàn)所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。（2）用過的玻璃器材：1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應(yīng)先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌，然后趁熱倒出培養(yǎng)基，用5％肥皂水刷洗，再用自來水沖凈后倒置架上，晾干備用。3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應(yīng)插入盛有消毒液（3~5％來蘇）的玻璃筒中（筒底應(yīng)墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時，最后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。5）注射器：用后若無病原微生物污染，立即用自來水將注射器及針頭等抽洗干凈；若有病原微生物污染，則立即進(jìn)行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應(yīng)用高壓蒸汽滅菌）。若用上述方法不能洗凈，可再置清潔液中浸泡數(shù)小時（針頭不能用清潔液泡），取出用自來水沖洗7次以上，干燥后備用。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花(不可太松或太緊)，然后每支分別用紙包好，或以數(shù)支放入金屬筒內(nèi)。（2）滅菌上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進(jìn)行滅菌。注意：任何已滅菌的器材。二、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序和方法培養(yǎng)基是用人工方法將細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般細(xì)菌生長所需要的基本營養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質(zhì)能為細(xì)菌提供生命所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細(xì)菌提供能量。1．培養(yǎng)基配制的基本程序包括：調(diào)配、溶化、矯正pH、過濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個主要步驟。（2）溶化：將調(diào)配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時攪拌，防止溶液外溢，溶解完畢，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH比色計和比色法測定PH較為準(zhǔn)確，后者無需特殊儀器。 試管號 培養(yǎng)基 蒸餾水 1（測試管） 5ml — 2（蒸餾水管） — 5ml —3（培養(yǎng)基管） 5ml — —第4管為標(biāo)準(zhǔn)PH比色管（配方見附錄二）。4 2 3 1 目測方向圖31 比色法若測定管偏酸或偏堿，、直到測定管的顏色與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時要緩慢，并準(zhǔn)確記錄加入的量，按下式計算培養(yǎng)基中需加入的量。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測一次PH，如仍未達(dá)到所需PH，再按上述方法進(jìn)行矯正。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時分裝傾注平板或制備營養(yǎng)培養(yǎng)基。2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱放置成斜面，斜面長度占試管長度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56~57℃維持1h，以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。5）過濾除菌：用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)液的滅菌。2）效果檢驗(yàn)：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌的生長情況、生化反應(yīng)等是否符合。2．常用培養(yǎng)基的配制和用途（見附錄一）3．培養(yǎng)基配制的注意事項(xiàng)（1）在進(jìn)行調(diào)配時應(yīng)在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分粘附在瓶壁上。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應(yīng)在矯正PH后加入。（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進(jìn)行分裝時應(yīng)注意無菌操作，傾注平板時培養(yǎng)基的溫度不能過高，否則冷凝水多，影響細(xì)菌的分離并易造成污染；也不能溫度過低，否則瓊脂過早凝固，使平板表面高低不平?！窘Y(jié)果記錄和報告】實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的接種培養(yǎng)法與生長現(xiàn)象的觀察【目的和要求】1．掌握無菌技術(shù)，建立無菌觀念；明確無菌操作時注意要點(diǎn)。3．熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法。2．培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌的接種工具1．接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見圖41）。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)實(shí)用的300~500W電熱鎳鉻絲。圖41 接種環(huán)和接種針 接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。主要用于液體標(biāo)本涂布接種。方法：（圖42）（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細(xì)菌。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。（5）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。方法：（圖43）（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。方法：（1）連續(xù)劃線法（圖44）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均勻涂布，然后運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。圖44 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法（2）分區(qū)劃線法（圖45）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無菌操作挑取少許菌落。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。圖46 斜面培養(yǎng)基接種法5．涂布接種法本法主要用于活菌計數(shù)和藥敏試驗(yàn)。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同濃度的藥物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。（1）方法：1）將標(biāo)本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度：10101010105等。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)：1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFU稀釋倍數(shù)7．細(xì)菌接種的注意事項(xiàng)（1）細(xì)菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要求進(jìn)行。（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進(jìn)行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應(yīng)拿在手上打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。（4）取菌時注意菌落不要取得太多，應(yīng)蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離出單個菌落。角，劃線要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標(biāo)記再放置溫箱孵育。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時進(jìn)行消毒處理。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上蓋下）置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1824h。2．CO2培養(yǎng)法（1）CO2孵育箱：能自動調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。（見圖47）圖47 燭缸法（3）化學(xué)法（重碳酸鈉鹽酸法）：，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標(biāo)本缸中，密封后傾斜容器，使二種試劑接觸混合產(chǎn)生CO2。3．微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%O10%CO85%N2的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍(lán)。每次觀察標(biāo)本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復(fù)使用。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密封罐蓋，使氣體釋放到罐中。袋中裝有催化劑鈀粒和2支安瓿，分別裝有HCO2發(fā)生器（化學(xué)藥品，成分同上）、指示劑美藍(lán)。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細(xì)管吸取標(biāo)本后接種于培養(yǎng)基中，待石蠟?zāi)毯笾?7℃孵育。（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。觀察要點(diǎn)：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有細(xì)菌生長。（2）有鞭毛的細(xì)菌：沿穿刺線向四周擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周圍培養(yǎng)基變渾濁（如大腸埃希菌）。