【正文】 ~5％來蘇）的玻璃筒中（筒底應(yīng)墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時，最后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般細菌生長所需要的基本營養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質(zhì)能為細菌提供生命所需的碳源、氮源、無機鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細菌提供能量。1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時分裝傾注平板或制備營養(yǎng)培養(yǎng)基。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應(yīng)在矯正PH后加入。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。角，將已挑取細菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均勻涂布，然后運用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時進行消毒處理。每次觀察標本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復(fù)使用。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。3．試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O1％鹽酸四甲基對苯二胺（或1％鹽酸二甲基對苯二胺）。2．甲基紅試驗（MR試驗）（1）原理：某些細菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進一步將丙酮酸分解成大量有機酸（甲酸、乙酸、乳酸等），加入甲基紅指示劑后顯紅色為試驗陽性。臨床應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。也可用于其他細菌的鑒別。3．菌種：大腸桿菌、枯草桿菌、葡萄球菌。（2）伸出任一手指在“消毒前”的培養(yǎng)基表面輕輕按一下，%碘酊、75%酒精做皮膚消毒（注意皮膚消毒方法）待干后，再在“消毒后”的培養(yǎng)基上輕輕一按。兩桶底部之間的空隙用來盛水，通過里面的電熱管使水加熱（或直接用明火對鍋底加熱）。4）加熱過程中，注意其壓力表指針勿超過警戒線。（2）試驗方法：1）取A、B、C 3個普通平板，分別將葡萄球菌劃線接種于平板上。不同種類的待測菌藥敏試驗選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見表71。紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動。5．質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗相同的方法測定對同種抗菌藥物的敏感性，標準菌株的抑菌環(huán)應(yīng)在預(yù)期的范圍內(nèi)。（2）抗菌藥物必須使用標準粉劑，不應(yīng)使用口服藥而影響其含量。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通常使用這兩種藥物代替甲氧西林測定葡萄球菌的耐藥性。（1）篩選試驗（紙片擴散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片 或頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片 或頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片） 2）方法：，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同KB法），之后放35℃溫箱中培養(yǎng)1618h觀察結(jié)果。當其他PBPs被β－內(nèi)酰胺類抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時，PBP2α可替代它們完成細菌細胞壁的合成，從而使細菌得以生存。3．結(jié)果判斷及報告將試管拿出逐一對光觀察，凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為對待測菌的最低抑菌濃度（MIC）。（4）培養(yǎng)溫度以35℃為宜。（3）細菌接種：用無菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于MH瓊脂表面均勻劃線接種，共劃3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60176?！驹噭┡c器材】1．培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白（MH）瓊脂或MH液體培養(yǎng)基（~）。若變?yōu)辄S色混濁，說芽胞未被殺滅，滅菌失敗。（3）注意事項：1）每次滅菌前應(yīng)檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài), 尤其是安全閥是否良好。（3）注意事項：1）滅菌時溫度不能超過180℃，否則布料、紙張等易起火燃燒。2）接種 以無菌方法用棉簽在瓊脂平板的一角(1/4處)來回劃線，去掉棉拭，然后用接種環(huán)在原劃線上過2~3下，接著往下劃線分離。、工作原理、使用方法、注意事項和應(yīng)用?！　　　　　　　　　　　　　∮|酶H２Ｏ２　→　H２O＋［Ｏ］２［Ｏ］→ Ｏ２　↑ （2）方法：方法1：取3%，或加入到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。（2）方法：1）將細菌種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24~48h。2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。2．掌握常用生化反應(yīng)的原理和方法。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。角，劃線要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（4）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。目前實驗室常用的是經(jīng)濟實用的300~500W電熱鎳鉻絲。2）效果檢驗：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細菌的生長情況、生化反應(yīng)等是否符合。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測一次PH，如仍未達到所需PH，再按上述方法進行矯正。注意：任何已滅菌的器材。因此，微生物實驗所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。四、不染色標本檢查法細菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點，不能判斷細菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。（2）染色：分為以下三步。三、特殊染色法細菌的細胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色。（2）化學(xué)學(xué)說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色。2．熒光顯微鏡的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達到一定亮度（約5~10min）后，對準光軸。（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。（3）油鏡：鏡頭標志為100或 100/，鏡頭最長，其上常刻有白色環(huán)圈，或“oil”字樣。4．實驗室常見生物危險實驗室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標本中的污染源在空氣中傳播、微生物氣溶膠的吸入）、直接傳播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚粘膜接觸（臨床標本中的傳染源通過破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的實驗室相關(guān)感染。BSL4實驗室必須與其他實驗室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng)，實驗操作須在Ⅲ級生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護服。（7）實驗完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹布將操作臺擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門窗。微生物學(xué)檢驗實驗指導(dǎo) 2009．7一、《微生物學(xué)檢驗》實驗?zāi)康囊?．通過實驗驗證理論知識，并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)。（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實驗室。根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實驗室因接觸可能含有致病微生物的標本，通常應(yīng)達到二級生物安全防護實驗室要求。實驗室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤﹑不良實驗技術(shù)以及儀器使用不當造成的。 2．油鏡的使用原理圖12 顯微鏡油鏡的使用原理油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標本片透過的光線，因玻片和空氣的折光率不同（玻璃n=，空氣n=），部分光線經(jīng)載玻片進入空氣后發(fā)生折射，不能進入接物鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。更換接物鏡時，卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺面上，并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內(nèi)。（2）裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。（3）通透性學(xué)說：革蘭陽性菌細胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫色時，乙醇不易進入，而且95％乙醇可使細胞壁脫水，細胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。1．細胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過程中應(yīng)隨時添加染液，冷卻后水洗。因此，不染色標本檢查法主要用于觀察細菌的動力，常用的方法有以下幾種。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時，再用自來水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內(nèi)數(shù)小時，將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來水反復(fù)沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用。在使用前不能隨意打開，一經(jīng)打開則不再認為是無菌的。（4）過濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過濾。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過久。一般要求接種環(huán)長5~8cm，直徑為2~4mm。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線接種法該法可將標本中的多種細菌分散成單個菌落，有利于細菌的分純和進一步鑒定。（4）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。半固體培養(yǎng)基接種時注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。使用時將物品放入箱內(nèi)，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進行抽氣、換氣（H2，CO2，N2）使之達到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。3．了解生化反應(yīng)在細菌鑒定及診斷中的重要意義。3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并可以選用不同的指示劑。2）取出，滴加數(shù)滴靛基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。方法2：挑取一環(huán)菌落置于清潔的載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。3）培養(yǎng) 寫上標記，將平板放35℃，18~24h培養(yǎng)。2）結(jié)束時，關(guān)閉電源，必須等箱內(nèi)的溫度降下與外面溫度相當時才可打開箱門取出物品，防止玻璃器皿爆裂和灼傷。整個過程，必須嚴格按照操作規(guī)程由專人操作，避免意外事故發(fā)生，確保安全。（4）適用范圍：耐高溫、高壓的物品，如金屬器械、玻璃器皿、生理鹽水、棉纖等的高壓滅菌。對于營養(yǎng)要求高的細菌，則需在MH培養(yǎng)基中加入其它營養(yǎng)成分。角，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置3~5min待瓊脂表面的水分稍干。平板的堆放不超過2塊，防止受熱不均。并以MIC報告之。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。3）結(jié)果判斷： 頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm符合以上任何一項即可認為該菌能產(chǎn)ESBLs。（1）原理：同紙片擴散法。4．注意事項（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗結(jié)果。（6）抑菌環(huán)的測量要仔細、精確。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板邊緣的距離應(yīng)不小于15mm。市場有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準。波長在200~300nm的紫外線有此殺菌作用，其中以265~266殺菌作用為最強。3）冷空氣必須排盡，但溫度并沒有達到121℃，影響滅菌效果，達不到徹底滅菌的目的。4．高壓蒸汽滅菌法（1）儀器：直立式高壓滅菌器（或手提式）構(gòu)造：高壓滅菌器為一雙層圓桶形的金屬鍋，外桶長而堅厚，耐高壓；內(nèi)桶短而薄，用以裝載滅菌物品。二、消毒滅菌試驗1．皮膚消毒試驗（1）取普通平板1個，用記號筆在平板底部將其劃分三格，并分別注明“消毒前”和“消毒后”和“對照”。2．試劑：%碘酊、75%酒精。（4）注意事項：培養(yǎng)基內(nèi)不能含有血液，也不宜用血平板上的菌落，否則會出現(xiàn)假陽性；陳舊培養(yǎng)物上的酶可能失活，所以細菌培養(yǎng)物要新鮮；臨床應(yīng)用：常用于葡萄球菌和鏈球菌屬間鑒別，前者為陽性，后者為陰性。（4）注意事項：靛基質(zhì)試劑具有較強的腐蝕性，使用時應(yīng)小心，勿滴落至皮膚、衣服或其他物品上。 臨床應(yīng)用： 可用于多種細菌的鑒別。2．培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白胨水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。（750mmHg），再充入無氧氮氣，反復(fù)三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無氧狀態(tài)，則指示劑美藍為無色。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。（1）活菌計數(shù)：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進入培養(yǎng)基中，；。（5）分裝　根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進行包扎。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。 2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。3）復(fù)染：用堿性美藍染1min，水洗，待干、鏡檢。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。3．注