【正文】 ~5％來(lái)蘇）的玻璃筒中（筒底應(yīng)墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過(guò)吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來(lái)水沖洗（若無(wú)病原微生物污染，則可用自來(lái)水浸泡或直接用自來(lái)水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時(shí)，最后用自來(lái)水沖洗7次以上，晾干備用。培養(yǎng)基的成分因種類(lèi)不同而異，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的基本營(yíng)養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能為細(xì)菌提供生命所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細(xì)菌提供能量。1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時(shí)分裝傾注平板或制備營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應(yīng)在矯正PH后加入。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均勻涂布，然后運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來(lái)回劃線(xiàn)。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時(shí)進(jìn)行消毒處理。每次觀察標(biāo)本后需重新抽氣換氣，用過(guò)的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復(fù)使用。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。3．試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O1％鹽酸四甲基對(duì)苯二胺（或1％鹽酸二甲基對(duì)苯二胺）。2．甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）（1）原理：某些細(xì)菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進(jìn)一步將丙酮酸分解成大量有機(jī)酸（甲酸、乙酸、乳酸等），加入甲基紅指示劑后顯紅色為試驗(yàn)陽(yáng)性。臨床應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。也可用于其他細(xì)菌的鑒別。3．菌種：大腸桿菌、枯草桿菌、葡萄球菌。（2）伸出任一手指在“消毒前”的培養(yǎng)基表面輕輕按一下，%碘酊、75%酒精做皮膚消毒（注意皮膚消毒方法）待干后，再在“消毒后”的培養(yǎng)基上輕輕一按。兩桶底部之間的空隙用來(lái)盛水，通過(guò)里面的電熱管使水加熱（或直接用明火對(duì)鍋底加熱）。4）加熱過(guò)程中，注意其壓力表指針勿超過(guò)警戒線(xiàn)。（2）試驗(yàn)方法：1）取A、B、C 3個(gè)普通平板，分別將葡萄球菌劃線(xiàn)接種于平板上。不同種類(lèi)的待測(cè)菌藥敏試驗(yàn)選擇不同的抗菌藥物，藥敏紙片的選擇見(jiàn)表71。紙片一旦接觸瓊脂表面，就不能再移動(dòng)。5．質(zhì)量控制：以新鮮傳代的金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下用與常規(guī)試驗(yàn)相同的方法測(cè)定對(duì)同種抗菌藥物的敏感性，標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌環(huán)應(yīng)在預(yù)期的范圍內(nèi)。（2）抗菌藥物必須使用標(biāo)準(zhǔn)粉劑，不應(yīng)使用口服藥而影響其含量。由于頭孢西丁和苯唑西林較甲氧西林穩(wěn)定，不易失活，通常使用這兩種藥物代替甲氧西林測(cè)定葡萄球菌的耐藥性。（1）篩選試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法）1）藥物紙片：頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片 或頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片 或頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片 或頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片） 2）方法：，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基表面貼上頭孢他啶等藥物紙片（同KB法），之后放35℃溫箱中培養(yǎng)1618h觀察結(jié)果。當(dāng)其他PBPs被β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抑制而不能發(fā)揮作用時(shí)，PBP2α可替代它們完成細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而使細(xì)菌得以生存。3．結(jié)果判斷及報(bào)告將試管拿出逐一對(duì)光觀察，凡無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為對(duì)待測(cè)菌的最低抑菌濃度（MIC）。（4）培養(yǎng)溫度以35℃為宜。（3）細(xì)菌接種：用無(wú)菌棉拭蘸取已調(diào)試的菌液，在管壁上稍加擠壓之后，手持棉拭于MH瓊脂表面均勻劃線(xiàn)接種，共劃3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60176。【試劑與器材】1．培養(yǎng)基：一般需氧和兼性厭氧菌采用水解酪蛋白（MH）瓊脂或MH液體培養(yǎng)基（~）。若變?yōu)辄S色混濁，說(shuō)芽胞未被殺滅，滅菌失敗。（3）注意事項(xiàng)：1）每次滅菌前應(yīng)檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態(tài), 尤其是安全閥是否良好。（3）注意事項(xiàng)：1）滅菌時(shí)溫度不能超過(guò)180℃，否則布料、紙張等易起火燃燒。2）接種 以無(wú)菌方法用棉簽在瓊脂平板的一角(1/4處)來(lái)回劃線(xiàn)，去掉棉拭，然后用接種環(huán)在原劃線(xiàn)上過(guò)2~3下，接著往下劃線(xiàn)分離。、工作原理、使用方法、注意事項(xiàng)和應(yīng)用?！　　　　　　　　　　　　　∮|酶H２Ｏ２　→　H２O＋［Ｏ］２［Ｏ］→ Ｏ２　↑ （2）方法：方法1：取3%，或加入到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。（2）方法：1）將細(xì)菌種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24~48h。2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。2．掌握常用生化反應(yīng)的原理和方法。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門(mén)，內(nèi)門(mén)通箱內(nèi)先關(guān)著。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無(wú)氧環(huán)境，用于專(zhuān)性厭氧菌培養(yǎng)。角，劃線(xiàn)要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)實(shí)用的300~500W電熱鎳鉻絲。2）效果檢驗(yàn)：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、生化反應(yīng)等是否符合。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測(cè)一次PH，如仍未達(dá)到所需PH，再按上述方法進(jìn)行矯正。注意：任何已滅菌的器材。因此，微生物實(shí)驗(yàn)所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。四、不染色標(biāo)本檢查法細(xì)菌未經(jīng)過(guò)染色呈無(wú)色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點(diǎn)，不能判斷細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。（2）染色：分為以下三步。三、特殊染色法細(xì)菌的細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色。（2）化學(xué)學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色。2．熒光顯微鏡的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開(kāi)啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度（約5~10min）后，對(duì)準(zhǔn)光軸。（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時(shí)，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。（3）油鏡：鏡頭標(biāo)志為100或 100/，鏡頭最長(zhǎng)，其上?？逃邪咨h(huán)圈，或“oil”字樣。4．實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)生物危險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標(biāo)本中的污染源在空氣中傳播、微生物氣溶膠的吸入）、直接傳播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚粘膜接觸（臨床標(biāo)本中的傳染源通過(guò)破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)感染。BSL4實(shí)驗(yàn)室必須與其他實(shí)驗(yàn)室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)操作須在Ⅲ級(jí)生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護(hù)服。（7）實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹布將操作臺(tái)擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門(mén)窗。微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 2009．7一、《微生物學(xué)檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?．通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論知識(shí)，并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)。（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來(lái)蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室因接觸可能含有致病微生物的標(biāo)本，通常應(yīng)達(dá)到二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室要求。實(shí)驗(yàn)室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤﹑不良實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及儀器使用不當(dāng)造成的。 2．油鏡的使用原理圖12 顯微鏡油鏡的使用原理油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標(biāo)本片透過(guò)的光線(xiàn)，因玻片和空氣的折光率不同（玻璃n=，空氣n=），部分光線(xiàn)經(jīng)載玻片進(jìn)入空氣后發(fā)生折射，不能進(jìn)入接物鏡，致使射入光線(xiàn)較少，物象不清晰。更換接物鏡時(shí)，卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺(tái)面上，并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內(nèi)。（2）裝好配對(duì)的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。（3）通透性學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫色時(shí)，乙醇不易進(jìn)入，而且95％乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。1．細(xì)胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)添加染液，冷卻后水洗。因此，不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力，常用的方法有以下幾種。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內(nèi)數(shù)小時(shí)，將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來(lái)水反復(fù)沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用。在使用前不能隨意打開(kāi)，一經(jīng)打開(kāi)則不再認(rèn)為是無(wú)菌的。（4）過(guò)濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過(guò)濾。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱(chēng)，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過(guò)久。一般要求接種環(huán)長(zhǎng)5~8cm，直徑為2~4mm。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線(xiàn)接種法該法可將標(biāo)本中的多種細(xì)菌分散成單個(gè)菌落，有利于細(xì)菌的分純和進(jìn)一步鑒定。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。半固體培養(yǎng)基接種時(shí)注意穿刺線(xiàn)要直，并沿原穿刺線(xiàn)退出。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。使用時(shí)將物品放入箱內(nèi)，先打開(kāi)外門(mén)，放入交換室，關(guān)上外門(mén)進(jìn)行抽氣、換氣（H2，CO2，N2）使之達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門(mén)打開(kāi)，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門(mén)。3．了解生化反應(yīng)在細(xì)菌鑒定及診斷中的重要意義。3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并可以選用不同的指示劑。2）取出，滴加數(shù)滴靛基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。方法2：挑取一環(huán)菌落置于清潔的載玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫溶液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。3）培養(yǎng) 寫(xiě)上標(biāo)記，將平板放35℃，18~24h培養(yǎng)。2）結(jié)束時(shí)，關(guān)閉電源，必須等箱內(nèi)的溫度降下與外面溫度相當(dāng)時(shí)才可打開(kāi)箱門(mén)取出物品，防止玻璃器皿爆裂和灼傷。整個(gè)過(guò)程，必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程由專(zhuān)人操作，避免意外事故發(fā)生，確保安全。（4）適用范圍：耐高溫、高壓的物品，如金屬器械、玻璃器皿、生理鹽水、棉纖等的高壓滅菌。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌，則需在MH培養(yǎng)基中加入其它營(yíng)養(yǎng)成分。角，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置3~5min待瓊脂表面的水分稍干。平板的堆放不超過(guò)2塊，防止受熱不均。并以MIC報(bào)告之。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。3）結(jié)果判斷： 頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm符合以上任何一項(xiàng)即可認(rèn)為該菌能產(chǎn)ESBLs。（1）原理：同紙片擴(kuò)散法。4．注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗(yàn)結(jié)果。（6）抑菌環(huán)的測(cè)量要仔細(xì)、精確。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板邊緣的距離應(yīng)不小于15mm。市場(chǎng)有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)。波長(zhǎng)在200~300nm的紫外線(xiàn)有此殺菌作用，其中以265~266殺菌作用為最強(qiáng)。3）冷空氣必須排盡，但溫度并沒(méi)有達(dá)到121℃，影響滅菌效果，達(dá)不到徹底滅菌的目的。4．高壓蒸汽滅菌法（1）儀器：直立式高壓滅菌器（或手提式）構(gòu)造：高壓滅菌器為一雙層圓桶形的金屬鍋，外桶長(zhǎng)而堅(jiān)厚，耐高壓；內(nèi)桶短而薄，用以裝載滅菌物品。二、消毒滅菌試驗(yàn)1．皮膚消毒試驗(yàn)（1）取普通平板1個(gè)，用記號(hào)筆在平板底部將其劃分三格，并分別注明“消毒前”和“消毒后”和“對(duì)照”。2．試劑：%碘酊、75%酒精。（4）注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基內(nèi)不能含有血液，也不宜用血平板上的菌落，否則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；陳舊培養(yǎng)物上的酶可能失活，所以細(xì)菌培養(yǎng)物要新鮮；臨床應(yīng)用：常用于葡萄球菌和鏈球菌屬間鑒別，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。（4）注意事項(xiàng)：靛基質(zhì)試劑具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)小心，勿滴落至皮膚、衣服或其他物品上。 臨床應(yīng)用： 可用于多種細(xì)菌的鑒別。2．培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白胨水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。（750mmHg），再充入無(wú)氧氮?dú)猓磸?fù)三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無(wú)氧狀態(tài)，則指示劑美藍(lán)為無(wú)色。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。（1）活菌計(jì)數(shù)：，用無(wú)菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開(kāi)大約30~45176。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進(jìn)入培養(yǎng)基中，；。（5）分裝　根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進(jìn)行包扎。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類(lèi)，其區(qū)別主要是凝固劑的有無(wú)和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。 2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來(lái)水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見(jiàn)附錄二）浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來(lái)水沖洗7次以上，晾干備用。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。3）復(fù)染：用堿性美藍(lán)染1min，水洗，待干、鏡檢。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。2．方法 （1）涂片：取清潔無(wú)油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線(xiàn)將其分成左右兩格。3．注