【正文】 中，密封袋口，先將袋中裝有化學(xué)藥品的安瓿折斷，幾分鐘后再折斷裝有美藍(lán)的安瓿，若美藍(lán)為無色則表示袋內(nèi)已處于無氧狀態(tài)，置35℃溫箱孵育。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟?zāi)毯笃鸶艚^空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無氧狀態(tài)。使用時(shí)將物品放入箱內(nèi)，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進(jìn)行抽氣、換氣（H2，CO2，N2）使之達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。四、細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察1．液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：渾濁生長（如葡萄球菌）、沉淀生長（如鏈球菌）、菌膜生長（如枯草桿菌）。觀察要點(diǎn)：注意觀察穿刺線是否清晰、周圍的培養(yǎng)基是否混濁。菌苔：由多個(gè)菌落融合而成，可能含有雜菌。3．了解生化反應(yīng)在細(xì)菌鑒定及診斷中的重要意義。4．其他：接種環(huán)（針）、酒精燈、毛細(xì)滴管、生物安全柜、培養(yǎng)箱、水浴箱、濾紙條等。一、糖（醇、苷）的分解代謝試驗(yàn)1．葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn) （1）原理：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于半固體的葡萄糖發(fā)酵管中，經(jīng)37℃1824h培養(yǎng)，大腸埃希菌因?yàn)榉纸馄渲械钠咸烟亲罱K產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。 2）細(xì)菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別穿刺接種于半固體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃ 18~24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并可以選用不同的指示劑。而另一些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌則分解葡萄糖產(chǎn)酸少，并將酸分解生成醇、酮、醛等，使甲基紅試劑顯黃色，為試驗(yàn)陰性。3．VP（VogesProskauer）試驗(yàn)（伏普試驗(yàn)） （1）原理：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌）將葡萄糖分解成丙酮酸之后，能進(jìn)一步使丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中所含精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色的化合物。 （3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽性。2）取出，滴加數(shù)滴靛基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。2．硫化氫試驗(yàn) （1）原理：某些細(xì)菌（如變形桿菌）能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬離子如Pb2+或Fe2+等，形成硫化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀。三、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)1．原理：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣腸桿菌等）能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鈉作為唯一的碳源，利用培養(yǎng)基中的磷酸二氫銨（銨鹽）作為唯一的氮源，在培養(yǎng)基上生長。如培養(yǎng)基接種線上長出菌落，但不見藍(lán)色也認(rèn)為是陽性；培養(yǎng)基不變色，無細(xì)菌生長者為陰性。方法2：挑取一環(huán)菌落置于清潔的載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。 2. 氧化酶試驗(yàn)（1）原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，某些細(xì)菌具有該種酶類。方法3：試劑紙片法，先將濾紙浸泡于試劑中制成試劑紙條，試驗(yàn)時(shí)揩取菌落涂于試劑紙上。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。4．其他器材：接種環(huán)、培養(yǎng)箱、無菌三角燒瓶、無菌吸管、無菌平皿、酒精燈、無菌棉簽、水浴箱、超凈工作臺(tái)、無菌紙片、無菌玻璃片、鑷子等。2）用無菌吸管吸取1ml水樣以無菌技術(shù)加入無菌平皿中。（3）注意事項(xiàng)：1）注意無菌操作，防止空氣或人體上的細(xì)菌污染。3）培養(yǎng) 寫上標(biāo)記，將平板放35℃，18~24h培養(yǎng)。剩下一格為空白對(duì)照。另外的2管不加熱作對(duì)照。頂部有風(fēng)扇和排氣孔，能及時(shí)排除里面的濕氣。2）結(jié)束時(shí)，關(guān)閉電源，必須等箱內(nèi)的溫度降下與外面溫度相當(dāng)時(shí)才可打開箱門取出物品，防止玻璃器皿爆裂和灼傷。鍋蓋厚重，利用多個(gè)旋鈕緊閉壓力鍋，其上有安全閥、放氣閥和壓力表（含溫度表）等構(gòu)件，觀察壓力表可及時(shí)了解鍋內(nèi)的壓力或溫度。將準(zhǔn)備滅菌的物品包扎好，裝入高壓鍋的內(nèi)桶中，物品放置不宜過多、過擠。（ kg/cm2）時(shí)，開始計(jì)時(shí)，并設(shè)法使其維持15~20min。整個(gè)過程，必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程由專人操作，避免意外事故發(fā)生，確保安全。如果出現(xiàn)這種情況，要及時(shí)冷靜地處理，首先應(yīng)去除熱源（電源），讓壓力緩緩回落。檢測(cè)方法如下：①化學(xué)指示法：利用化學(xué)指示劑在一定溫度與作用時(shí)間條件下受熱變色或變形的特點(diǎn)，以判斷是否達(dá)到滅菌所需溫度。通常利用耐熱的非致病性嗜熱脂肪芽孢桿菌作指示菌。（4）適用范圍：耐高溫、高壓的物品，如金屬器械、玻璃器皿、生理鹽水、棉纖等的高壓滅菌。2）然后用鑷子將無菌紙片貼在A平板中央，將無菌玻璃片貼于B平板中央，C平板不貼物品作對(duì)照。（4）注意事項(xiàng)：1）作室內(nèi)空氣消毒時(shí)，通常事先關(guān)閉室內(nèi)的門、窗，打開紫外燈之后隨即離開，讓其照射30min?！窘Y(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥性檢測(cè)【目的和要求】（KB法）、液體稀釋法兩種藥敏試驗(yàn)的原理和方法。對(duì)于營養(yǎng)要求高的細(xì)菌，則需在MH培養(yǎng)基中加入其它營養(yǎng)成分。3．待測(cè)細(xì)菌 接種普通營養(yǎng)瓊脂經(jīng)35℃16~18h的純培養(yǎng)物。：無菌生理鹽水、無菌棉簽、無菌試管、酒精燈、鑷子、生物安全柜、培養(yǎng)箱等。2．方法（1）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：將無菌MH瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無菌的直徑90mm平皿中。角，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置3~5min待瓊脂表面的水分稍干。（5）培養(yǎng)：貼好藥物紙片的平板應(yīng)于室溫下放置15min，然后翻轉(zhuǎn)平板，放35℃培養(yǎng)18~24h之后觀察結(jié)果。制備平板時(shí)，注意其厚度并且厚薄要均勻。紙片應(yīng)在有效期內(nèi)使用。平板的堆放不超過2塊，防止受熱不均。如超出了該范圍，則不能向臨床發(fā)報(bào)告，應(yīng)及時(shí)查出原因，予以糾正。2．方法（1）抗菌藥物原液的配制：試驗(yàn)用的抗菌藥物應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)的粉劑，選擇適宜的溶劑和稀釋劑進(jìn)行溶解和稀釋（表72），并配成一定濃度（通常為1000U或1000μg/ml）的藥物原液。 2）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml），充分混合后，從中吸出2ml分別加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管，從最后一管吸出1ml棄去；經(jīng)如此稀釋，各管的藥物濃度依次為512512631；另設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照、待測(cè)菌生長對(duì)照和質(zhì)控菌生長對(duì)照管。并以MIC報(bào)告之。配好后的藥物原液應(yīng)在有效期使用。5．質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)應(yīng)選用金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC2592糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下作平行試驗(yàn)。三、部分細(xì)菌耐藥表型的檢測(cè)1．耐甲氧西林葡萄球菌的檢測(cè)（頭孢西丁紙片擴(kuò)散法）甲氧西林(methicillin)是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。（2）方法：以無菌棉拭蘸取已調(diào)試的待測(cè)菌液接種于MH瓊脂平板上（同KB法），再貼上頭孢西丁藥物紙片（30μg/片）或苯唑西林藥物紙片（1μg/片），將平板置于35℃培養(yǎng)24h，之后觀察結(jié)果。苯唑西林紙片法結(jié)果需對(duì)著透射光線觀察，抑菌環(huán)內(nèi)有任何可辨別的細(xì)菌生長即為苯唑西林耐藥。并具有多重耐藥和轉(zhuǎn)移迅速等特點(diǎn)，極易導(dǎo)致院內(nèi)交叉感染和耐藥菌的擴(kuò)散。3）結(jié)果判斷： 頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm符合以上任何一項(xiàng)即可認(rèn)為該菌能產(chǎn)ESBLs。對(duì)ESBLs有多種方法可以進(jìn)行檢測(cè)，目前主要采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）所推薦的紙片擴(kuò)散法、稀釋法，并分篩選實(shí)驗(yàn)和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)兩步進(jìn)行。2．腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended spectrum βlactamase,ESBLs）是指能水解青霉素類和頭孢菌素類抗生素并擴(kuò)展到能水解第三、第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素并由質(zhì)粒介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥13 mm為敏感，≤10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥18 mm為敏感，≤17 mm為耐藥。（1）原理：同紙片擴(kuò)散法。這種PBP2α不但與β－內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低，而且具有其他高親合力青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的功能。6．臨床意義：多用于抗菌藥物抗菌效力的測(cè)定，新藥開發(fā)。（3）試驗(yàn)過程易污染，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。4．注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗(yàn)結(jié)果。4）培養(yǎng)：置35℃培養(yǎng)12~18h后觀察結(jié)果。（2）待測(cè)菌液的準(zhǔn)備：分純的平板上挑取4~5個(gè)菌落，接種于3~5ml MH肉湯中35℃培養(yǎng)4~6h，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，再用MH肉湯按1∶200稀釋，并在15min內(nèi)接種。 6．臨床意義：用于臨床細(xì)菌常規(guī)藥敏檢測(cè)，監(jiān)測(cè)細(xì)菌的耐藥變遷，指導(dǎo)臨床用藥。（6）抑菌環(huán)的測(cè)量要仔細(xì)、精確。此外，菌液配好后應(yīng)在15min內(nèi)用完。藥物紙片應(yīng)始終保存在封閉、冷凍、干燥的環(huán)境，否則會(huì)影響其活性。4．注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都可以造成影響。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板邊緣的距離應(yīng)不小于15mm。（2）試驗(yàn)菌液準(zhǔn)備：將待測(cè)細(xì)菌接種于普通瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16~18h，然后從平板上挑取數(shù)個(gè)菌落，于2~，調(diào)整濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相同，其細(xì)菌濃度相當(dāng)于108 CFU/ml。在紙片周圍，一定濃度的藥物抑制了細(xì)菌的生長從而形成了透明的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)的大小則反映了待測(cè)菌對(duì)該種藥物的敏感程度。用前混勻。市場有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)。、方法及意義。2） 紫外燈殺菌的有效距離為2~3m。4）照射后， 用無菌鑷子去掉平板上的紙片和玻璃片，蓋好平板，將所有平板一起放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。波長在200~300nm的紫外線有此殺菌作用，其中以265~266殺菌作用為最強(qiáng)。若培養(yǎng)后顏色未變，澄清透明，說明芽胞已被殺滅，達(dá)到了滅菌要求。②留點(diǎn)溫度計(jì)法：滅菌后看溫度是否達(dá)到滅菌所需溫度。6）滅菌器用過之后應(yīng)及時(shí)排除鍋內(nèi)的水，敞開蓋子讓水蒸汽蒸發(fā)，可防止高壓滅菌器生銹。3）冷空氣必須排盡，但溫度并沒有達(dá)到121℃，影響滅菌效果，達(dá)不到徹底滅菌的目的。待壓力表降至“0”時(shí)，擰松旋鈕，半開鍋蓋，用鍋內(nèi)余熱烘干水汽，10min后取出滅菌物品。2）加熱 接通電源，開始加熱。 Kpa()時(shí)，℃，維持15~30min，可以殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有的微生物。4．高壓蒸汽滅菌法（1）儀器：直立式高壓滅菌器（或手提式）構(gòu)造：高壓滅菌器為一雙層圓桶形的金屬鍋，外桶長而堅(jiān)厚，耐高壓；內(nèi)桶短而薄，用以裝載滅菌物品。（2）操作方法：將待滅菌的物品置一帶蓋的搪瓷盒（或金屬盒）中包扎，放入烤箱，接通電源，160~170℃維持2~3h。3．干熱滅菌法（1）儀器：干烤箱構(gòu)造：為一填充有絕熱材料的雙層金屬箱。2．煮沸消毒試驗(yàn)（1）將大腸桿菌和枯草桿菌分別種于2管肉湯培養(yǎng)基中。二、消毒滅菌試驗(yàn)1．皮膚消毒試驗(yàn)（1）取普通平板1個(gè)，用記號(hào)筆在平板底部將其劃分三格，并分別注明“消毒前”和“消毒后”和“對(duì)照”。3．人體咽喉部細(xì)菌檢查 （1）方法：1）采樣 持無菌棉拭1根，待受試者張大嘴巴后，迅速伸入對(duì)方懸臃垂后的咽喉部，輕輕揩取咽喉壁上的分泌物。待瓊脂凝固后，將其放入35℃，培養(yǎng)18~24h。（2）結(jié)果觀察：對(duì)光觀察瓊脂平板上菌落的有無，計(jì)數(shù)并紀(jì)錄結(jié)果。2．試劑：%碘酊、75%酒精。、特點(diǎn)和應(yīng)用。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對(duì)照。 （2）方法：方法1：菌落法，直接將試劑滴加于平板的被檢菌菌落上。（4）注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基內(nèi)不能含有血液，也不宜用血平板上的菌落，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性；陳舊培養(yǎng)物上的酶可能失活，所以細(xì)菌培養(yǎng)物要新鮮；臨床應(yīng)用：常用于葡萄球菌和鏈球菌屬間鑒別，前者為陽性，后者為陰性。四、呼吸酶類試驗(yàn)（過氧化氫酶）試驗(yàn)（1）原理：某些細(xì)菌（如葡萄球菌等）可分泌過氧化氫酶，該酶能催化過氧化氫產(chǎn)生水和初生態(tài)氧，因?yàn)檠醴肿拥男纬晒士梢姎馀莩霈F(xiàn)。 2．方法：用接種針挑取待測(cè)細(xì)菌穿刺于枸櫞酸鈉培養(yǎng)基并抽出于斜面劃線接種，置35℃，18~24h培養(yǎng)。（3）結(jié)果觀察：穿刺線周圍出現(xiàn)黑色者為陽性。（4）注意事項(xiàng)：靛基質(zhì)試劑具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)小心，勿滴落至皮膚、衣服或其他物品上。二、蛋白質(zhì)（或氨基酸）代謝試驗(yàn)1．靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)（1）原理：某些細(xì)菌（如大腸埃希菌等）能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)（吲哚），當(dāng)加入靛基質(zhì)試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛）之后，靛基質(zhì)與對(duì)二甲氨基苯甲醛作用生成紅色化合物—玫瑰靛基質(zhì)。（2）方法：1）接種環(huán)取細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水，置35℃培養(yǎng)48h。 2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動(dòng)試管，培養(yǎng)液立即顯紅色者為試驗(yàn)陽性，黃色者為陰性。 臨床應(yīng)用： 可用于多種細(xì)菌的鑒別。 （4）注意事項(xiàng)：1）發(fā)酵管的制備、細(xì)菌的接種均應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。通過觀察培養(yǎng)基顏色變化以及氣體的有無即可鑒別細(xì)菌。生化反應(yīng)在細(xì)菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細(xì)菌檢驗(yàn)所常用。2．培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白胨水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。【結(jié)果記錄和報(bào)告】 實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的生化反應(yīng)【目的和要求】1．掌握細(xì)菌生化反應(yīng)的概念。因來源相同，同一個(gè)菌落的細(xì)菌為純種細(xì)菌。2．半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：（1）無鞭毛的細(xì)菌：僅沿穿刺線生長，穿刺線清晰，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球菌）。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作。（4）平皿焦性沒食子酸法：（也可用Na2CO3）的比例