【文章內容簡介】 入的量。計算：，現配制1000ml培養(yǎng)基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測一次PH，如仍未達到所需PH，再按上述方法進行矯正。（4）過濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過濾。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。（5）分裝　根據需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進行包扎。1）基礎培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時分裝傾注平板或制備營養(yǎng)培養(yǎng)基。滅菌后的基礎培養(yǎng)基在傾注平板前應冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝于無菌平皿內（直徑9cm的平皿分裝量約13~15ml），待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉，即為瓊脂平板。2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱放置成斜面，斜面長度占試管長度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。（6）滅菌 根據培養(yǎng)基的成分、性質采用不同的滅菌方法。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質配制的培養(yǎng)基滅菌。3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56~57℃維持1h，以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。5）過濾除菌：用于血清、細胞培養(yǎng)液的滅菌。（7）鑒定 包括兩項內容：1）無菌試驗：將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長為合格。2）效果檢驗：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細菌的生長情況、生化反應等是否符合。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過久。2．常用培養(yǎng)基的配制和用途（見附錄一）3．培養(yǎng)基配制的注意事項（1）在進行調配時應在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分粘附在瓶壁上。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質的容器，若鐵進入培養(yǎng)基中，；。某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應在矯正PH后加入。（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個雞蛋的卵蛋白加水20ml，攪拌至出現泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸汽加熱30~60min，使培養(yǎng)基中的不溶性物質附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或濾紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進行分裝時應注意無菌操作，傾注平板時培養(yǎng)基的溫度不能過高，否則冷凝水多，影響細菌的分離并易造成污染；也不能溫度過低，否則瓊脂過早凝固，使平板表面高低不平。（4）在加熱溶化時注意溶液不能溢出瓶外，否則會影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應補足失去的水分?！窘Y果記錄和報告】實驗四 細菌的接種培養(yǎng)法與生長現象的觀察【目的和要求】1．掌握無菌技術，建立無菌觀念；明確無菌操作時注意要點。2．掌握細菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。3．熟悉細菌生長現象的觀察方法?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。2．培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機、記號筆等?！緦嶒瀮热荨恳弧⒓毦慕臃N工具1．接種環(huán)和接種針：其結構包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見圖41）。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經久耐用，但因為價格昂貴而限制了其應用。目前實驗室常用的是經濟實用的300~500W電熱鎳鉻絲。一般要求接種環(huán)長5~8cm，直徑為2~4mm。圖41 接種環(huán)和接種針 接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內壓緊。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。主要用于液體標本涂布接種。二、細菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細菌的增菌培養(yǎng)或進行細菌的生化反應。方法：（圖42）（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細菌。（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開，試管口通過火焰燒灼滅菌。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數次，使細菌均勻分布于培養(yǎng)基中。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（5）在試管上做好標記，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細菌的動力或進行細菌的生化反應。方法：（圖43）（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。（4）在試管上做好標記，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線接種法該法可將標本中的多種細菌分散成單個菌落，有利于細菌的分純和進一步鑒定。方法：（1）連續(xù)劃線法（圖44）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。角，將已挑取細菌的接種環(huán)先在平板一側邊緣均勻涂布，然后運用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細菌污染。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。4）在平板底上做好標記，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖44 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法（2）分區(qū)劃線法（圖45）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。2）同上法將平板蓋打開約30~45176。角，將已挑取細菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內作來回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。4）在平板底上做好標記，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細菌的純培養(yǎng)，以進一步鑒定細菌或保存菌種。（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無菌操作挑取少許菌落。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（4）在試管上做好標記，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果。圖46 斜面培養(yǎng)基接種法5．涂布接種法本法主要用于活菌計數和藥敏試驗。（1）活菌計數：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經35℃培養(yǎng)18~24h后計數菌落，則每毫升所含活菌數=菌落數10稀釋倍數。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內加入不同濃度的藥物，經35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結果，測定抑菌圈直徑，按判斷標準判定結果。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標本或樣品中活菌計數。（1）方法：1）將標本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度：10101010105等。2）取不同稀釋度的標本各1ml分別注入直徑90mm無菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉動平板使之充分混勻，待凝固后翻轉平板。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計數菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標本中的細菌數：1ml標本中的活菌數=全平板CFU稀釋倍數7．細菌接種的注意事項（1）細菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴格按要求進行。操作時不宜說話或將口鼻靠近培養(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細菌污染培養(yǎng)基。（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應拿在手上打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。（4）取菌時注意菌落不要取得太多，應蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離出單個菌落。（5）平板劃線時注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40176。角，劃線要密而不重復，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。半固體培養(yǎng)基接種時注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標記再放置溫箱孵育。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。發(fā)生有菌材料污染應及時進行消毒處理。三、細菌的培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法 該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上蓋下）置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1824h。大多數細菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現象，但若標本中的菌量少或生長速度慢的細菌（如結核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現象。2．CO2培養(yǎng)法（1）CO2孵育箱：能自動調節(jié)箱內CO2的濃度和溫度，使用方便。（2）燭缸法：取一有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內放一支點燃的蠟燭，加蓋密封。隨著缸內蠟燭燃燒產生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時缸內的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結果。（見圖47）圖47 燭缸法（3）化學法（重碳酸鈉鹽酸法）：，分別將二種試劑置于容器內，將容器放置在標本缸中，密封后傾斜容器，使二種試劑接觸混合產生CO2。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。3．微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內的空氣排盡，再注入5%O10%CO85%N2的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結果。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。4．厭氧培養(yǎng)法：（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍。（750mmHg），再充入無氧氮氣，反復三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內呈無氧狀態(tài)，則指示劑美藍為無色。每次觀察標本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經160℃2h干烤后可重復使用。2）氣體發(fā)生袋法（Gaspak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內有金屬網狀容器，其內裝有厭氧指示劑美藍和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內裝有硼氫化鈉氯化鈷合劑、碳酸氫鈉檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學反應，產生H2和CO2。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內，密封罐蓋，使氣體釋放到罐中。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復合塑料薄膜制成。袋中裝有催化劑鈀粒和2支安瓿，分別裝有HCO2發(fā)生器（化學藥品，成分同上）、指示劑美藍。使用時將接種細菌的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學藥品的安瓿折斷，幾分鐘后再折斷裝有美藍的安瓿，若美藍為無色則表示袋內已處于無氧狀態(tài)，置35℃溫箱孵育。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。（4）平皿焦性沒食子酸法：（也可用Na2CO3）的比例，先將焦性沒食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗布中，再滴入NaOH，立即將接種細菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置35℃溫箱培養(yǎng)。（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細管吸取標本后接種于培養(yǎng)基中，待石蠟凝固后置37℃孵育。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟凝固后起隔絕空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內呈無氧狀態(tài)。（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國際上公認的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套