【正文】 2）培養(yǎng)溫度應(yīng)為33~35℃，超過35℃耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長而漏檢。如果標(biāo)準(zhǔn)菌株的試驗(yàn)結(jié)果超過或低于預(yù)期值一個(gè)稀釋度以上，不應(yīng)發(fā)出臨床報(bào)告，而應(yīng)找出差錯(cuò)的原因。原液以過濾法除菌，小量分裝使用，放20℃以下一般可保存三個(gè)月，如果置4℃只能保存一周。（2）藥物紙片的貼放要均勻，并且要充分接觸瓊脂。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、 紙片擴(kuò)散法（KB法）藥敏試驗(yàn)1．原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測細(xì)菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿紙片周圍由高濃度向低濃度擴(kuò)散，形成逐漸減少的梯度濃度。返回時(shí)，應(yīng)先管好燈，避免長時(shí)間暴露在紫外燈下工作，紫外線對(duì)眼睛和皮膚均有損傷。苯甲酸的熔點(diǎn)為121~123℃，滅菌后看到苯甲酸粉末變成液態(tài)，冷卻后成固體，表示已達(dá)到滅菌的目的。然后蓋嚴(yán)鍋蓋，以對(duì)角的順序均勻擰緊鍋蓋上的旋鈕之后，檢查關(guān)閉鍋蓋上的氣閥和所有開關(guān)。（3）將各管置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。3）趁熱（不燙手為宜），傾注約15ml的普通瓊脂，立即在臺(tái)面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混勻。（3）結(jié)果觀察：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色者為陽性。最終有碳酸鈉和氨（NH3）產(chǎn)生，使培養(yǎng)基變堿，使其中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由淡綠色變成深藍(lán)色。故在培養(yǎng)基中加入含胍基的化合物（如肌酸或肌酐等），可加速該反應(yīng)。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無氣泡。3．固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：菌落：由一個(gè)細(xì)菌生長繁殖而形成的一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個(gè)大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計(jì)數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)：1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFU稀釋倍數(shù)7．細(xì)菌接種的注意事項(xiàng)（1）細(xì)菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要求進(jìn)行。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。3．熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH比色計(jì)和比色法測定PH較為準(zhǔn)確，后者無需特殊儀器。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。【結(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)三 滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準(zhǔn)備。2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色1min，水洗。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。2．試劑：革蘭染色液、細(xì)胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。鏡檢時(shí)應(yīng)將標(biāo)本按一定方向呈“弓”形移動(dòng)，直至整個(gè)標(biāo)本觀察完畢，以防漏檢。2．器材及其他：光學(xué)顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。（8）有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)施，如高壓蒸汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置、應(yīng)急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等?；谝陨蟿澐謽?biāo)準(zhǔn)，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預(yù)防和治療措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對(duì)各種病原微生物的危害程度及其相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)需要達(dá)到的生物安全實(shí)驗(yàn)室級(jí)別做了詳細(xì)分類，各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)均需參照此標(biāo)準(zhǔn)。（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室的安靜、整潔和有序。（1）試驗(yàn)前須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法和注意事?xiàng)，做到心中有數(shù)，避免發(fā)生錯(cuò)誤，提高實(shí)驗(yàn)效率。三、生物安全防護(hù)知識(shí)簡介醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標(biāo)本，這些標(biāo)本往往是各種細(xì)菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實(shí)驗(yàn)人員感染，還是造成實(shí)驗(yàn)室和周圍環(huán)境的污染，都將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。（6）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免反光和強(qiáng)光。2．掌握細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標(biāo)本置載物臺(tái)上，用彈簧夾和推進(jìn)器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺(tái)至不能升高為止。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。3．熟悉不染色標(biāo)本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。固定的目的在于殺死細(xì)菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著色。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時(shí)從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動(dòng)。在消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時(shí)有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。（4）在加熱溶化時(shí)注意溶液不能溢出瓶外，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。二、細(xì)菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。大多數(shù)細(xì)菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長速度慢的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。2．半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：（1）無鞭毛的細(xì)菌：僅沿穿刺線生長，穿刺線清晰，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球菌）。生化反應(yīng)在細(xì)菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細(xì)菌檢驗(yàn)所常用。 2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動(dòng)試管，培養(yǎng)液立即顯紅色者為試驗(yàn)陽性，黃色者為陰性。（3）結(jié)果觀察：穿刺線周圍出現(xiàn)黑色者為陽性。 （2）方法：方法1：菌落法，直接將試劑滴加于平板的被檢菌菌落上。（2）結(jié)果觀察：對(duì)光觀察瓊脂平板上菌落的有無，計(jì)數(shù)并紀(jì)錄結(jié)果。2．煮沸消毒試驗(yàn)（1）將大腸桿菌和枯草桿菌分別種于2管肉湯培養(yǎng)基中。 Kpa()時(shí)，℃，維持15~30min，可以殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有的微生物。6）滅菌器用過之后應(yīng)及時(shí)排除鍋內(nèi)的水，敞開蓋子讓水蒸汽蒸發(fā)，可防止高壓滅菌器生銹。4）照射后， 用無菌鑷子去掉平板上的紙片和玻璃片，蓋好平板，將所有平板一起放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。用前混勻。4．注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都可以造成影響。 6．臨床意義：用于臨床細(xì)菌常規(guī)藥敏檢測，監(jiān)測細(xì)菌的耐藥變遷，指導(dǎo)臨床用藥。（3）試驗(yàn)過程易污染，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥13 mm為敏感，≤10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥18 mm為敏感，≤17 mm為耐藥。并具有多重耐藥和轉(zhuǎn)移迅速等特點(diǎn)，極易導(dǎo)致院內(nèi)交叉感染和耐藥菌的擴(kuò)散。三、部分細(xì)菌耐藥表型的檢測1．耐甲氧西林葡萄球菌的檢測（頭孢西丁紙片擴(kuò)散法）甲氧西林(methicillin)是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。 2）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml），充分混合后，從中吸出2ml分別加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管，從最后一管吸出1ml棄去；經(jīng)如此稀釋，各管的藥物濃度依次為512512631；另設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照、待測菌生長對(duì)照和質(zhì)控菌生長對(duì)照管。紙片應(yīng)在有效期內(nèi)使用。2．方法（1）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：將無菌MH瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無菌的直徑90mm平皿中?！窘Y(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥性檢測【目的和要求】（KB法）、液體稀釋法兩種藥敏試驗(yàn)的原理和方法。通常利用耐熱的非致病性嗜熱脂肪芽孢桿菌作指示菌。（ kg/cm2）時(shí)，開始計(jì)時(shí)，并設(shè)法使其維持15~20min。頂部有風(fēng)扇和排氣孔，能及時(shí)排除里面的濕氣。（3）注意事項(xiàng)：1）注意無菌操作，防止空氣或人體上的細(xì)菌污染。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。如培養(yǎng)基接種線上長出菌落，但不見藍(lán)色也認(rèn)為是陽性；培養(yǎng)基不變色，無細(xì)菌生長者為陰性。 （3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽性。 2）細(xì)菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別穿刺接種于半固體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃ 18~24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。菌苔：由多個(gè)菌落融合而成，可能含有雜菌。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟?zāi)毯笃鸶艚^空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無氧狀態(tài)。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時(shí)要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的純培養(yǎng)，以進(jìn)一步鑒定細(xì)菌或保存菌種。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細(xì)菌的動(dòng)力或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機(jī)、記號(hào)筆等。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。將4支試管按圖31所示插入比色架中進(jìn)行比色。4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞?！驹噭┡c器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍(lán)色。觀察時(shí)應(yīng)從細(xì)菌較少的地方尋找鞭毛。（4）所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會(huì)降低染液濃度，影響染色效果。單染法是用一種染料去染，所有細(xì)菌都染成一種顏色；復(fù)染法是用多種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，不同細(xì)菌可染成不同的顏色。（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺(tái)上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學(xué)顯微鏡。4．注意事項(xiàng)（1）顯微鏡是精密光學(xué)儀器，在搬放時(shí)應(yīng)右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。二、光學(xué)顯微鏡油鏡的使用1．光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造光學(xué)顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)最常用的一種儀器，其構(gòu)造分為機(jī)械部分和光學(xué)部分，機(jī)械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺(tái)、鏡筒、鏡頭轉(zhuǎn)換器、調(diào)焦裝置等；光學(xué)部分包括：接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖11）。（11）在實(shí)驗(yàn)室入口處和裝有傳染性物質(zhì)的設(shè)備表面貼有生物危險(xiǎn)標(biāo)志。二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL2）適用于對(duì)人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物，即危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體，該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。（6）用過的污染物品應(yīng)放到指定的地點(diǎn)，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進(jìn)行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。4．在實(shí)驗(yàn)過程中逐漸培養(yǎng)獨(dú)立思考問題、分析問題和解決問題的能力。（3）燒傷：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（3）實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外有足夠的存儲(chǔ)空間及擺放個(gè)人衣物的設(shè)施。5．生物廢棄材料的管理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴(yán)禁未經(jīng)處理就隨意丟棄，應(yīng)置于貼有生物危害標(biāo)志的專用廢棄物處理容器內(nèi)，注意容器的充滿量不能超過其設(shè)計(jì)容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應(yīng)置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終處置前應(yīng)存放在指定的安全地方，經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放；動(dòng)物尸體、組織的處置和焚化應(yīng)符合國家相關(guān)要求。將低倍鏡轉(zhuǎn)到中央并對(duì)準(zhǔn)下面的聚光器，打開光圈，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光源時(shí)，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時(shí)用平面反光鏡）。若油鏡鏡頭上的油跡未擦干凈，應(yīng)先將1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇醚混合液或二甲苯擦凈。（2）使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)間不宜太長．因標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，即有熒光減弱現(xiàn)象。用接種環(huán)先挑取生理鹽水1~2環(huán)于載玻片每格中央，再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻。結(jié)果：有細(xì)胞壁的細(xì)菌僅菌體周邊染成紫色，菌體內(nèi)部無色；無細(xì)胞壁的細(xì)菌（如L型細(xì)菌）整個(gè)菌體都染成紫色。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞染成紅色。先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應(yīng)插入盛有消毒液（3