【正文】 轉(zhuǎn)到中央并對準下面的聚光器，打開光圈，轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光源時，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時用平面反光鏡）。2．特殊結(jié)構(gòu)的觀察（莢膜、芽胞、鞭毛）觀察要點：注意這些特殊結(jié)構(gòu)的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細菌的鑒定。5．生物廢棄材料的管理實驗室內(nèi)所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴禁未經(jīng)處理就隨意丟棄，應(yīng)置于貼有生物危害標志的專用廢棄物處理容器內(nèi)，注意容器的充滿量不能超過其設(shè)計容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應(yīng)置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終處置前應(yīng)存放在指定的安全地方，經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運出實驗室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放；動物尸體、組織的處置和焚化應(yīng)符合國家相關(guān)要求。（10）在實驗室出口處設(shè)有在黑暗中可明確辨認方向、通道的標識。（3）實驗室工作區(qū)域外有足夠的存儲空間及擺放個人衣物的設(shè)施。根據(jù)WHO《實驗室生物安全手冊》和我國衛(wèi)生部2002年頒布的《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》，實驗室從生物安全防護的角度共分為四級：一級生物安全防護實驗室（BSL1）為實驗室結(jié)構(gòu)設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于危險度1級的微生物，依據(jù)標準操作程序可進行開放性操作，如用于教學的普通微生物實驗室即屬此類。（3）燒傷：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（5）實驗中注意節(jié)約試劑，愛護儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應(yīng)立即報告老師及時作適當處理。4．在實驗過程中逐漸培養(yǎng)獨立思考問題、分析問題和解決問題的能力。二、微生物學實驗室規(guī)則及實驗室意外處理方法1．微生物學實驗室規(guī)則由于微生物學實驗是以病原微生物為研究對象，在實驗過程中任何疏忽大意都有可能引起實驗人員的自身感染或?qū)嶒炇液椭車h(huán)境的污染。（6）用過的污染物品應(yīng)放到指定的地點，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。（4）菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高錳酸鉀或3%過氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當抗生素預防感染。二級生物安全防護實驗室（BSL2）適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物，即危險度2級的病原體，該級別實驗室應(yīng)具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。（4）實驗室內(nèi)墻壁、地面應(yīng)平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。（11）在實驗室入口處和裝有傳染性物質(zhì)的設(shè)備表面貼有生物危險標志。處理危險廢棄物的人員需經(jīng)過專業(yè)培訓，并使用適當?shù)姆雷o設(shè)備。二、光學顯微鏡油鏡的使用1．光學顯微鏡的構(gòu)造光學顯微鏡是觀察細菌形態(tài)最常用的一種儀器，其構(gòu)造分為機械部分和光學部分，機械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、鏡頭轉(zhuǎn)換器、調(diào)焦裝置等；光學部分包括：接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖11）。根據(jù)所觀察的標本，通過升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。4．注意事項（1）顯微鏡是精密光學儀器，在搬放時應(yīng)右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。（7）顯微鏡擦凈后，取下標本片，下降聚光器，再將物鏡轉(zhuǎn)成“品”字形，送至顯微鏡室放入鏡箱內(nèi)。（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學顯微鏡?！窘Y(jié)果記錄和報告】實驗二 細菌的形態(tài)學檢查【目的和要求】1．熟悉細菌染色的常用染料和一般程序。單染法是用一種染料去染，所有細菌都染成一種顏色；復染法是用多種染料對細菌進行染色，不同細菌可染成不同的顏色。（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠處微微加熱烘干，但切勿靠近火焰。（4）所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會降低染液濃度，影響染色效果。2．鞭毛染色法（改良Ryu法）鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意動作盡量輕，以免鞭毛脫落。觀察時應(yīng)從細菌較少的地方尋找鞭毛。4．莢膜染色法（1）黑斯氏法1）涂片，自然干燥，加熱固定。結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍色。2．懸滴法取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林?！驹噭┡c器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3~5％的來蘇液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時，最后用自來水洗凈，晾干備用。4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。其他培養(yǎng)基大多是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營養(yǎng)物質(zhì)、抑菌劑、檢測基質(zhì)、指示劑等）配制而成。將4支試管按圖31所示插入比色架中進行比色。滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在傾注平板前應(yīng)冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝于無菌平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿分裝量約13~15ml），待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉(zhuǎn)，即為瓊脂平板。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個雞蛋的卵蛋白加水20ml，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸汽加熱30~60min，使培養(yǎng)基中的不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或濾紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機、記號筆等。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細菌的動力或進行細菌的生化反應(yīng)。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細菌污染。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細菌的純培養(yǎng)，以進一步鑒定細菌或保存菌種。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。三、細菌的培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法 該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。2）氣體發(fā)生袋法（Gaspak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉氯化鈷合劑、碳酸氫鈉檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學反應(yīng)，產(chǎn)生H2和CO2。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟凝固后起隔絕空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無氧狀態(tài)。四、細菌生長現(xiàn)象的觀察1．液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：渾濁生長（如葡萄球菌）、沉淀生長（如鏈球菌）、菌膜生長（如枯草桿菌）。菌苔：由多個菌落融合而成，可能含有雜菌。4．其他：接種環(huán)（針）、酒精燈、毛細滴管、生物安全柜、培養(yǎng)箱、水浴箱、濾紙條等。 2）細菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別穿刺接種于半固體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃ 18~24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。而另一些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌則分解葡萄糖產(chǎn)酸少，并將酸分解生成醇、酮、醛等，使甲基紅試劑顯黃色，為試驗陰性。 （3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽性。2．硫化氫試驗 （1）原理：某些細菌（如變形桿菌）能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬離子如Pb2+或Fe2+等，形成硫化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀。如培養(yǎng)基接種線上長出菌落，但不見藍色也認為是陽性；培養(yǎng)基不變色，無細菌生長者為陰性。 2. 氧化酶試驗（1）原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，某些細菌具有該種酶類。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應(yīng)。4．其他器材：接種環(huán)、培養(yǎng)箱、無菌三角燒瓶、無菌吸管、無菌平皿、酒精燈、無菌棉簽、水浴箱、超凈工作臺、無菌紙片、無菌玻璃片、鑷子等。（3）注意事項：1）注意無菌操作，防止空氣或人體上的細菌污染。剩下一格為空白對照。頂部有風扇和排氣孔，能及時排除里面的濕氣。鍋蓋厚重，利用多個旋鈕緊閉壓力鍋，其上有安全閥、放氣閥和壓力表（含溫度表）等構(gòu)件，觀察壓力表可及時了解鍋內(nèi)的壓力或溫度。（ kg/cm2）時，開始計時，并設(shè)法使其維持15~20min。如果出現(xiàn)這種情況，要及時冷靜地處理，首先應(yīng)去除熱源（電源），讓壓力緩緩回落。通常利用耐熱的非致病性嗜熱脂肪芽孢桿菌作指示菌。2）然后用鑷子將無菌紙片貼在A平板中央，將無菌玻璃片貼于B平板中央，C平板不貼物品作對照?！窘Y(jié)果記錄和報告】實驗七 細菌的藥敏試驗及耐藥性檢測【目的和要求】（KB法）、液體稀釋法兩種藥敏試驗的原理和方法。3．待測細菌 接種普通營養(yǎng)瓊脂經(jīng)35℃16~18h的純培養(yǎng)物。2．方法（1）培養(yǎng)基的準備：將無菌MH瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無菌的直徑90mm平皿中。（5）培養(yǎng)：貼好藥物紙片的平板應(yīng)于室溫下放置15min，然后翻轉(zhuǎn)平板，放35℃培養(yǎng)18~24h之后觀察結(jié)果。紙片應(yīng)在有效期內(nèi)使用。如超出了該范圍，則不能向臨床發(fā)報告，應(yīng)及時查出原因，予以糾正。 2）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml），充分混合后，從中吸出2ml分別加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管，從最后一管吸出1ml棄去；經(jīng)如此稀釋，各管的藥物濃度依次為512512631；另設(shè)培養(yǎng)基對照、待測菌生長對照和質(zhì)控菌生長對照管。配好后的藥物原液應(yīng)在有效期使用。三、部分細菌耐藥表型的檢測1．耐甲氧西林葡萄球菌的檢測（頭孢西丁紙片擴散法）甲氧西林(methicillin)是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。（2）方法：以無菌棉拭蘸取已調(diào)試的待測菌液接種于MH瓊脂平板上（同KB法），再貼上頭孢西丁藥物紙片（30μg/片）或苯唑西林藥物紙片（1μg/片），將平板置于35℃培養(yǎng)24h，之后觀察結(jié)果。并具有多重耐藥和轉(zhuǎn)移迅速等特點，極易導致院內(nèi)交叉感染和耐藥菌的擴散。對ESBLs有多種方法可以進行檢測，目前主要采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）所推薦的紙片擴散法、稀釋法，并分篩選實驗和確認實驗兩步進行。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥13 mm為敏感，≤10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥18 mm為敏感，≤17 mm為耐藥。這種PBP2α不但與β－內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低，而且具有其他高親合力青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的功能。（3）試驗過程易污染，應(yīng)嚴格無菌操作。4）培養(yǎng)：置35℃培養(yǎng)12~18h后觀察結(jié)果。 6．臨床意義：用于臨床細菌常規(guī)藥敏檢測，監(jiān)測細菌的耐藥變遷，指導臨床用藥。此外，菌液配好后應(yīng)在15min內(nèi)用完。4．注意事項（1）培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對試驗結(jié)果都可以造成影響。（2）試驗菌液準備：將待測細菌接種于普通瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16~18h，然后從平板上挑取數(shù)個菌落，于2~，調(diào)整濁度與標準比濁管相同，其細菌濃度相當于108 CFU/ml。用前混勻。、方法及意義。4）照射后， 用無菌鑷子去掉平板上的紙片和玻璃片，蓋好平板，將所有平板一起放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。若培養(yǎng)后顏色未變，澄清透明，說明芽胞已被殺滅，達到了滅菌要求。6）滅菌器用過之后應(yīng)及時排除鍋內(nèi)的水，敞開蓋子讓水蒸汽蒸發(fā)，可防止高壓滅菌器生銹。待壓力表降至“0”時，擰松旋鈕，半開鍋蓋，用鍋內(nèi)余熱烘干水汽，10min后取出滅菌物品。 Kpa()時，℃，維持15~30min，可以殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有的微生物。（2）操作方法：將待滅菌的物品置一帶蓋的搪瓷盒（或金屬盒）中包扎，放入烤箱，接通電源，160~170℃維持2~3h。2．煮沸消毒試驗（1）將大腸桿菌和枯草桿菌分別種于2管肉湯培養(yǎng)基中。3．人體咽喉部細菌檢查 （1）方法：1）采樣 持無菌棉拭1根，待受試者張大嘴巴后，迅速伸入對方懸臃垂后的咽喉部，輕輕揩取咽喉壁上的分泌物。（2）結(jié)果觀察：對光觀察瓊脂平板上菌落的有無，計數(shù)并紀錄結(jié)果。、特點和應(yīng)用。 （2）方法：方法1：菌落法，直接將試劑滴加于平板的被檢菌菌落上。四、呼吸酶類試驗（過氧化氫酶）試驗（1）原理：某些細菌（如葡萄球菌等）可分泌過氧化氫酶，該酶能催化過氧化氫產(chǎn)生水和初生態(tài)氧，因為氧分子的形成故可見氣泡出現(xiàn)。（3）結(jié)果觀察：穿刺線周圍出現(xiàn)黑色者為陽性。二、蛋白質(zhì)（或氨基酸）代謝試驗1．靛基質(zhì)（吲哚）試驗（1）原理：某些細菌（如大腸埃希菌等）能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)（吲哚），當加入靛基質(zhì)試劑（對二甲氨基苯甲醛）之后，靛基質(zhì)與對二甲氨基苯甲醛作用生成紅色化合物—玫瑰靛基質(zhì)。 2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動試管，培養(yǎng)液立即顯紅色者為試驗陽性，黃色者為陰性。 （4）注意事項：1）發(fā)酵管的制備、細菌的接種均應(yīng)嚴格無菌操作。生化反應(yīng)在細菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細菌檢驗所常用。【結(jié)果記錄和報告】 實驗五 細菌的生化反應(yīng)