【正文】 轉到中央并對準下面的聚光器，打開光圈，轉動反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光源時，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時用平面反光鏡）。2．特殊結構的觀察（莢膜、芽胞、鞭毛）觀察要點：注意這些特殊結構的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細菌的鑒定。5．生物廢棄材料的管理實驗室內所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴禁未經處理就隨意丟棄，應置于貼有生物危害標志的專用廢棄物處理容器內，注意容器的充滿量不能超過其設計容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應置于耐扎銳器盒內，在去污染或最終處置前應存放在指定的安全地方，經過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運出實驗室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經無害化處理后排放；動物尸體、組織的處置和焚化應符合國家相關要求。（10）在實驗室出口處設有在黑暗中可明確辨認方向、通道的標識。（3）實驗室工作區(qū)域外有足夠的存儲空間及擺放個人衣物的設施。根據WHO《實驗室生物安全手冊》和我國衛(wèi)生部2002年頒布的《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》，實驗室從生物安全防護的角度共分為四級：一級生物安全防護實驗室（BSL1）為實驗室結構設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于危險度1級的微生物，依據標準操作程序可進行開放性操作，如用于教學的普通微生物實驗室即屬此類。（3）燒傷：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（5）實驗中注意節(jié)約試劑，愛護儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應立即報告老師及時作適當處理。4．在實驗過程中逐漸培養(yǎng)獨立思考問題、分析問題和解決問題的能力。二、微生物學實驗室規(guī)則及實驗室意外處理方法1．微生物學實驗室規(guī)則由于微生物學實驗是以病原微生物為研究對象，在實驗過程中任何疏忽大意都有可能引起實驗人員的自身感染或實驗室和周圍環(huán)境的污染。（6）用過的污染物品應放到指定的地點，經專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。（4）菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高錳酸鉀或3%過氧化氫漱口，根據菌種服用適當抗生素預防感染。二級生物安全防護實驗室（BSL2）適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物，即危險度2級的病原體，該級別實驗室應具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產生氣溶膠。（4）實驗室內墻壁、地面應平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。（11）在實驗室入口處和裝有傳染性物質的設備表面貼有生物危險標志。處理危險廢棄物的人員需經過專業(yè)培訓，并使用適當的防護設備。二、光學顯微鏡油鏡的使用1．光學顯微鏡的構造光學顯微鏡是觀察細菌形態(tài)最常用的一種儀器，其構造分為機械部分和光學部分，機械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、鏡頭轉換器、調焦裝置等；光學部分包括：接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖11）。根據所觀察的標本，通過升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。4．注意事項（1）顯微鏡是精密光學儀器，在搬放時應右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。（7）顯微鏡擦凈后，取下標本片，下降聚光器，再將物鏡轉成“品”字形，送至顯微鏡室放入鏡箱內。（3）調節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學顯微鏡?！窘Y果記錄和報告】實驗二 細菌的形態(tài)學檢查【目的和要求】1．熟悉細菌染色的常用染料和一般程序。單染法是用一種染料去染，所有細菌都染成一種顏色；復染法是用多種染料對細菌進行染色，不同細菌可染成不同的顏色。（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠處微微加熱烘干，但切勿靠近火焰。（4）所有染液應防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會降低染液濃度，影響染色效果。2．鞭毛染色法（改良Ryu法）鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意動作盡量輕，以免鞭毛脫落。觀察時應從細菌較少的地方尋找鞭毛。4．莢膜染色法（1）黑斯氏法1）涂片，自然干燥，加熱固定。結果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍色。2．懸滴法取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林?！驹噭┡c器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3~5％的來蘇液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數小時，最后用自來水洗凈，晾干備用。4）注射器：最好將內芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。其他培養(yǎng)基大多是在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營養(yǎng)物質、抑菌劑、檢測基質、指示劑等）配制而成。將4支試管按圖31所示插入比色架中進行比色。滅菌后的基礎培養(yǎng)基在傾注平板前應冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝于無菌平皿內（直徑9cm的平皿分裝量約13~15ml），待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉，即為瓊脂平板。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個雞蛋的卵蛋白加水20ml，攪拌至出現泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸汽加熱30~60min，使培養(yǎng)基中的不溶性物質附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或濾紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機、記號筆等。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細菌的動力或進行細菌的生化反應。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細菌污染。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細菌的純培養(yǎng)，以進一步鑒定細菌或保存菌種。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。三、細菌的培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法 該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。2）氣體發(fā)生袋法（Gaspak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內有金屬網狀容器，其內裝有厭氧指示劑美藍和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內裝有硼氫化鈉氯化鈷合劑、碳酸氫鈉檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學反應，產生H2和CO2。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟凝固后起隔絕空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內呈無氧狀態(tài)。四、細菌生長現象的觀察1．液體培養(yǎng)基中的生長現象：渾濁生長（如葡萄球菌）、沉淀生長（如鏈球菌）、菌膜生長（如枯草桿菌）。菌苔：由多個菌落融合而成，可能含有雜菌。4．其他：接種環(huán)（針）、酒精燈、毛細滴管、生物安全柜、培養(yǎng)箱、水浴箱、濾紙條等。 2）細菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別穿刺接種于半固體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃ 18~24h培養(yǎng)后觀察結果。而另一些細菌如產氣腸桿菌則分解葡萄糖產酸少，并將酸分解生成醇、酮、醛等，使甲基紅試劑顯黃色，為試驗陰性。 （3）結果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽性。2．硫化氫試驗 （1）原理：某些細菌（如變形桿菌）能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸等），產生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬離子如Pb2+或Fe2+等，形成硫化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀。如培養(yǎng)基接種線上長出菌落，但不見藍色也認為是陽性；培養(yǎng)基不變色，無細菌生長者為陰性。 2. 氧化酶試驗（1）原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，某些細菌具有該種酶類。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。4．其他器材：接種環(huán)、培養(yǎng)箱、無菌三角燒瓶、無菌吸管、無菌平皿、酒精燈、無菌棉簽、水浴箱、超凈工作臺、無菌紙片、無菌玻璃片、鑷子等。（3）注意事項：1）注意無菌操作，防止空氣或人體上的細菌污染。剩下一格為空白對照。頂部有風扇和排氣孔，能及時排除里面的濕氣。鍋蓋厚重，利用多個旋鈕緊閉壓力鍋，其上有安全閥、放氣閥和壓力表（含溫度表）等構件，觀察壓力表可及時了解鍋內的壓力或溫度。（ kg/cm2）時，開始計時，并設法使其維持15~20min。如果出現這種情況，要及時冷靜地處理，首先應去除熱源（電源），讓壓力緩緩回落。通常利用耐熱的非致病性嗜熱脂肪芽孢桿菌作指示菌。2）然后用鑷子將無菌紙片貼在A平板中央，將無菌玻璃片貼于B平板中央，C平板不貼物品作對照。【結果記錄和報告】實驗七 細菌的藥敏試驗及耐藥性檢測【目的和要求】（KB法）、液體稀釋法兩種藥敏試驗的原理和方法。3．待測細菌 接種普通營養(yǎng)瓊脂經35℃16~18h的純培養(yǎng)物。2．方法（1）培養(yǎng)基的準備：將無菌MH瓊脂加熱融化，趁熱傾注入無菌的直徑90mm平皿中。（5）培養(yǎng)：貼好藥物紙片的平板應于室溫下放置15min，然后翻轉平板，放35℃培養(yǎng)18~24h之后觀察結果。紙片應在有效期內使用。如超出了該范圍，則不能向臨床發(fā)報告，應及時查出原因，予以糾正。 2）藥物稀釋：吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml），充分混合后，從中吸出2ml分別加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混勻后吸出1ml加入到第三管，以此類推直至最后一管，從最后一管吸出1ml棄去；經如此稀釋，各管的藥物濃度依次為512512631；另設培養(yǎng)基對照、待測菌生長對照和質控菌生長對照管。配好后的藥物原液應在有效期使用。三、部分細菌耐藥表型的檢測1．耐甲氧西林葡萄球菌的檢測（頭孢西丁紙片擴散法）甲氧西林(methicillin)是一種能耐青霉素酶的半合成青霉素。（2）方法：以無菌棉拭蘸取已調試的待測菌液接種于MH瓊脂平板上（同KB法），再貼上頭孢西丁藥物紙片（30μg/片）或苯唑西林藥物紙片（1μg/片），將平板置于35℃培養(yǎng)24h，之后觀察結果。并具有多重耐藥和轉移迅速等特點，極易導致院內交叉感染和耐藥菌的擴散。對ESBLs有多種方法可以進行檢測，目前主要采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）所推薦的紙片擴散法、稀釋法，并分篩選實驗和確認實驗兩步進行。苯唑西林紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥13 mm為敏感，≤10 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥18 mm為敏感，≤17 mm為耐藥。這種PBP2α不但與β－內酰胺類抗生素的親和力極低，而且具有其他高親合力青霉素結合蛋白(PBPs)的功能。（3）試驗過程易污染，應嚴格無菌操作。4）培養(yǎng)：置35℃培養(yǎng)12~18h后觀察結果。 6．臨床意義：用于臨床細菌常規(guī)藥敏檢測，監(jiān)測細菌的耐藥變遷，指導臨床用藥。此外，菌液配好后應在15min內用完。4．注意事項（1）培養(yǎng)基的成分、酸堿度以及平板的厚度等對試驗結果都可以造成影響。（2）試驗菌液準備：將待測細菌接種于普通瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16~18h，然后從平板上挑取數個菌落，于2~，調整濁度與標準比濁管相同，其細菌濃度相當于108 CFU/ml。用前混勻。、方法及意義。4）照射后， 用無菌鑷子去掉平板上的紙片和玻璃片，蓋好平板，將所有平板一起放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結果。若培養(yǎng)后顏色未變，澄清透明，說明芽胞已被殺滅，達到了滅菌要求。6）滅菌器用過之后應及時排除鍋內的水，敞開蓋子讓水蒸汽蒸發(fā)，可防止高壓滅菌器生銹。待壓力表降至“0”時，擰松旋鈕，半開鍋蓋，用鍋內余熱烘干水汽，10min后取出滅菌物品。 Kpa()時，℃，維持15~30min，可以殺滅包括芽胞在內的所有的微生物。（2）操作方法：將待滅菌的物品置一帶蓋的搪瓷盒（或金屬盒）中包扎，放入烤箱，接通電源，160~170℃維持2~3h。2．煮沸消毒試驗（1）將大腸桿菌和枯草桿菌分別種于2管肉湯培養(yǎng)基中。3．人體咽喉部細菌檢查 （1）方法：1）采樣 持無菌棉拭1根，待受試者張大嘴巴后，迅速伸入對方懸臃垂后的咽喉部，輕輕揩取咽喉壁上的分泌物。（2）結果觀察：對光觀察瓊脂平板上菌落的有無，計數并紀錄結果。、特點和應用。 （2）方法：方法1：菌落法，直接將試劑滴加于平板的被檢菌菌落上。四、呼吸酶類試驗（過氧化氫酶）試驗（1）原理：某些細菌（如葡萄球菌等）可分泌過氧化氫酶，該酶能催化過氧化氫產生水和初生態(tài)氧，因為氧分子的形成故可見氣泡出現。（3）結果觀察：穿刺線周圍出現黑色者為陽性。二、蛋白質（或氨基酸）代謝試驗1．靛基質（吲哚）試驗（1）原理：某些細菌（如大腸埃希菌等）能分解蛋白胨中的色氨酸產生靛基質（吲哚），當加入靛基質試劑（對二甲氨基苯甲醛）之后，靛基質與對二甲氨基苯甲醛作用生成紅色化合物—玫瑰靛基質。 2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動試管，培養(yǎng)液立即顯紅色者為試驗陽性，黃色者為陰性。 （4）注意事項：1）發(fā)酵管的制備、細菌的接種均應嚴格無菌操作。生化反應在細菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細菌檢驗所常用?！窘Y果記錄和報告】 實驗五 細菌的生化反應