【正文】 上香柏油（或水），再將標本夾在移動尺上。（3）調節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學顯微鏡。四、熒光顯微鏡1．構造：（1）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用150~200瓦高壓汞燈。（2）濾光片：1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標本和保護眼睛。2．熒光顯微鏡的使用方法：（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達到一定亮度（約5~10min）后，對準光軸。（2）裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。操作同光學顯微鏡。3．注意事項（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時一經(jīng)開啟不宜中斷，斷電后需待汞燈冷卻后（約15min）方能再啟用。（2）使用熒光顯微鏡觀察標本時間不宜太長．因標本在高壓汞燈下照射超過3min，即有熒光減弱現(xiàn)象?！窘Y果記錄和報告】實驗二 細菌的形態(tài)學檢查【目的和要求】1．熟悉細菌染色的常用染料和一般程序。2．掌握革蘭染色的方法、原理、結果觀察及意義。3．熟悉不染色標本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結果觀察。4．熟悉細菌的特殊染色法?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。2．試劑：革蘭染色液、細胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。3．其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等?！緦嶒瀮热荨恳?、細菌染色的一般程序細菌染色法分單染法和復染法。單染法是用一種染料去染，所有細菌都染成一種顏色；復染法是用多種染料對細菌進行染色，不同細菌可染成不同的顏色。大部分細菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根據(jù)實驗目的選擇不同的染色方法，在實際工作中，應用最廣泛的是革蘭染色法。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點學說：革蘭陽性菌的等電點（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結晶紫）結合性牢固，不易脫色。（2）化學學說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進入胞漿內的結晶紫和碘牢固結合成大分子復合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質少，故易被乙醇脫色。（3）通透性學說：革蘭陽性菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層較厚，含脂質少，脫色時，乙醇不易進入，而且95％乙醇可使細胞壁脫水，細胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結晶紫和碘復合物滲出。 而革蘭陰性菌細胞壁結構疏松，肽聚糖層較薄，含脂質多，易被乙醇溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內的結晶紫與碘復合物易被溶出而脫色。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。用接種環(huán)先挑取生理鹽水1~2環(huán)于載玻片每格中央，再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻。（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠處微微加熱烘干，但切勿靠近火焰。（3）固定：干燥后的標本片在酒精燈火焰上來回通過3次（以鐘擺的速度），冷卻后染色。固定的目的在于殺死細菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細胞質，改變細菌對染料的通透性，使細菌易與染料結合而著色。（4）染色：分以下四步：1min，水洗 1min，水洗 ，水洗 ，水洗結晶紫 盧戈碘液 95％乙醇 稀釋石炭酸復紅 待干、鏡檢（初染） （媒染） （脫色） （復染）3．結果：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。4．注意事項：（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過字跡為宜（半透明）。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。（2）脫色時間長短要適宜，如果涂片較厚應相應的延長脫色時間，如涂片較薄則相應的縮短脫色時間，脫色時應不斷旋轉玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可。（3）水洗時，水流不能過大，防止水流直接對準菌膜沖洗。（4）所有染液應防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會降低染液濃度，影響染色效果。（5）因細菌的菌齡不同染色結果也有差異，一般以18~24h培養(yǎng)物染色結果最好。5．醫(yī)學意義：通過革蘭染色有助于細菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細菌的致病性。三、特殊染色法細菌的細胞壁、核質、胞漿顆粒和細菌的特殊結構如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用相應的特殊染色法才能染上顏色。1．細胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定標本15min，水洗。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。結果：有細胞壁的細菌僅菌體周邊染成紫色，菌體內部無色；無細胞壁的細菌（如L型細菌）整個菌體都染成紫色。2．鞭毛染色法（改良Ryu法）鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意動作盡量輕，以免鞭毛脫落。培養(yǎng)基應為營養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營養(yǎng)瓊脂），不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國藍、MAC等）。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。若水滴向周圍流散而不形成水珠表示玻片處理良好。（2）在玻片上加蒸餾水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細菌點在蒸餾水滴的頂部（一般只需點一下，僅允許極少量細菌進入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動，以免鞭毛脫落。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10~15min后，將玻片微傾斜，用蒸餾水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。（5）玻片自然干燥后鏡檢。觀察時應從細菌較少的地方尋找鞭毛。結果：鞭毛染成紅色。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。（2）染色：分為以下三步。1）初染：在菌膜上加石炭酸復紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過程中應隨時添加染液，冷卻后水洗。2）脫色：用95%乙醇脫色1～2min，水洗。3）復染：用堿性美藍染1min，水洗，待干、鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞染成紅色。4．莢膜染色法（1）黑斯氏法1）涂片，自然干燥，加熱固定。2）滴加結晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。結果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無色。（2）密爾氏法1）涂片：，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加熱固定。2）滴加石炭酸復紅染液，微火加熱染色1min，水洗。3），水洗。4）加堿性美藍染色1min，水洗，待干，鏡檢。結果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍色。5．異染顆粒染色細菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見附錄二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、鏡檢。結果：菌體染成藍綠色，異染顆粒染成藍黑色。四、不染色標本檢查法細菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點，不能判斷細菌的形態(tài)和結構特征。因此，不染色標本檢查法主要用于觀察細菌的動力，常用的方法有以下幾種。1．壓滴法用接種環(huán)分別取菌液2～3環(huán)，置于潔凈載玻片中央。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細菌的運動。2．懸滴法取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片凹窩對準蓋玻片上的菌液，迅速翻轉載玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊封閉（見圖21），置顯微鏡下觀察。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細菌運動活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動。觀察要點：有鞭毛的細菌運動活潑，可向不同方向迅速運動，位置移動明顯。無鞭毛細菌不能做真正的運動，但受水分子的撞擊而呈分子運動（布朗運動），即在一定范圍內作來回顫動，位置移動不大，注意與細菌的鞭毛運動相鑒別?！窘Y果記錄和報告】實驗三 滅菌前的準備與基礎培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準備。2．熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。3．掌握基礎培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項。【試劑與器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。2．器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙等?！緦嶒瀮热荨恳?、常用玻璃器材的洗滌和準備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣嶒灲Y果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化學物質的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學反應的結果，如在pH3時可發(fā)生酸凝集。因此，微生物實驗所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時，再用自來水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內數(shù)小時，將游離的雜質除去，最后用自來水反復沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用。（2）用過的玻璃器材：1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌，然后趁熱倒出培養(yǎng)基，用5％肥皂水刷洗，再用自來水沖凈后倒置架上，晾干備用。 2）試管：作血清反應的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應插入盛有消毒液（3~5％來蘇）的玻璃筒中（筒底應墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時，最后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3~5％的來蘇液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時，最后用自來水洗凈，晾干備用。5）注射器：用后若無病原微生物污染，立即用自來水將注射器及針頭等抽洗干凈；若有病原微生物污染，則立即進行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應用高壓蒸汽滅菌）。在消毒或滅菌之前，均應先將清水抽入針頭及注射器內反復抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時有蛋白質凝固而阻塞針頭或注射器。若用上述方法不能洗凈，可再置清潔液中浸泡數(shù)小時（針頭不能用清潔液泡），取出用自來水沖洗7次以上，干燥后備用。2．常用無菌器材的準備（1）包裝1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應直立并扎成捆，以免滅菌時傾倒。3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花(不可太松或太緊)，然后每支分別用紙包好，或以數(shù)支放入金屬筒內。4）注射器：最好將內芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。（2）滅菌上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進行滅菌。如用干烤法應注意控制溫度和時間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。注意：任何已滅菌的器材。在使用前不能隨意打開，一經(jīng)打開則不再認為是無菌的。二、基礎培養(yǎng)基的制備程序和方法培養(yǎng)基是用人工方法將細菌生長所需要的營養(yǎng)物質按一定比例配制而成的營養(yǎng)基質。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎、營養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎培養(yǎng)基含有一般細菌生長所需要的基本營養(yǎng)成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質能為細菌提供生命所需的碳源、氮源、無機鹽、水分，并能調節(jié)菌體內外的滲透壓，為細菌提供能量。其他培養(yǎng)基大多是在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營養(yǎng)物質、抑菌劑、檢測基質、指示劑等）配制而成。1．培養(yǎng)基配制的基本程序包括：調配、溶化、矯正pH、過濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個主要步驟。（1）調配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。（2）溶化：將調配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時攪拌，防止溶液外溢，溶解完畢，應補足失去的水分。（3）矯正PH：用PH比色計、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH，~。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH比色計和比色法測定PH較為準確，后者無需特殊儀器。比色法：取3支與標準管口徑相同的試管，按下表加樣。 試管號 培養(yǎng)基 蒸餾水 1（測試管） 5ml — 2（蒸餾水管） — 5ml —3（培養(yǎng)基管） 5ml — —第4管為標準PH比色管（配方見附錄二）。將4支試管按圖31所示插入比色架中進行比色。4 2 3 1 目測方向圖31 比色法若測定管偏酸或偏堿，、直到測定管的顏色與標準管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時要緩慢，并準確記錄加入的量，按下式計算培養(yǎng)基中需加