微生物學實驗[最終定稿]-文庫吧
2025-10-15 04:07 本頁面
【正文】 結果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或污染程度的檢測。（三）器材1．菌種 大腸桿菌菌懸液。2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。（四）操作步驟l．編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標明1010106。(稀釋度)各3套。，依次標是1010101010106。2．稀釋用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。OptionsEmail Replies將101試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅?，整個過程如圖153所示。放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。3，取樣用三支1mL無菌吸管分別吸取10105和106。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中。，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。圖15—3平板菌落計數操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5．計數培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數稀釋倍數5一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數據統(tǒng)計，減少誤差。由1010106三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。五、實驗報告1．結果2．將培養(yǎng)后菌落計數結果填入下表稀釋度104105106Cfu數/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優(yōu)缺點及應用。(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計數，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結果?三 光電比濁計數法一、目的要求1．了解光電比濁計數法的原理。2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。二、基本原理當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖154)。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。制作標準曲線時，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數板計數。光電比濁計數法的優(yōu)點是簡便、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質的懸液不適合用此法進行測定。圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理（三）器材1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。（四）操作步驟1．標準曲線制作（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為5
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