【正文】 4實驗方法與步驟4．1 金黃色葡萄球菌檢測程序（如圖301）　　24h36+1℃24h36+1℃24h36+1℃24h36+1℃檢樣25g(ml)+225ml滅菌生理鹽水直接記數(shù)方法增菌培養(yǎng)方法、%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯血 平 板血平板，BairdParker平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶實驗報 告圖301 金黃色葡萄球菌檢測程序4．2 增菌培養(yǎng)法（1）檢樣處理稱取25g固體樣品或吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。（2）增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36177。1℃溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種于血平板和Baird－Parker平板上，36177。1℃培養(yǎng)24h，挑取可疑金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。（3）形態(tài)金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，～1μm。（4）培養(yǎng)特征在肉湯中呈混濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，也有時為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。（5）血漿凝固酶試驗吸取1∶，放入小試管中，振蕩搖勻，放36177。1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時呈現(xiàn)凝塊者，被認為陽性結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。4．3 直接計數(shù)法（1）吸取上述1：10混懸液，進行10倍系列稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入到三塊Baird－Parker平板中，、然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分不多吸收，可將平板放在36177。1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36177。1℃溫箱培養(yǎng)。（2）在三個平板上點數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個菌落，分別接種血平板，36177。1℃24h培養(yǎng)后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)法。（3）將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌的黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。5 實驗結(jié)果（1）金黃色葡萄球菌涂片染色鏡檢為陽性球菌，致病性葡萄球菌一般較非致病性葡萄球菌小，且各個菌體的大小排列也較整齊。細菌繁殖時呈多個平面的不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀。在中毒食品、膿汁或液體培養(yǎng)基中常呈單個或環(huán)球短鏈排列，易誤認為鏈球菌或細球菌。（2）金黃色葡萄球菌在血平板上菌落呈金黃色，周圍有溶血圈，在BairdParker平板上菌落呈灰黑色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。（3）致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽性。6 注意事項（1）在做樣品中金黃色葡萄球菌計數(shù)進行10倍遞次稀釋時，要注意每個稀釋度更換吸管。（2）實驗中操作者須注意生物安全防護，實驗結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實驗材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。7 思考題（1）金黃色葡萄球菌引起食物中毒的機理是什么？（2）為什么采用血漿凝固酶試驗來決定葡萄球菌致病和不致病?實驗4 食品中溶血性鏈球菌的檢測1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中溶血性鏈球菌的檢測方法。（2）觀察溶血性鏈球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板上菌落特征及溶血情況。（3）觀察乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)生鏈激酶的現(xiàn)象以及桿菌肽敏感實驗結(jié)果。2 基本原理乙型（β）溶血性鏈球菌致病性強，能產(chǎn)生溶血毒素，在血平板上生長，可使菌落周圍形成一個有2～4mm寬，界限分明，完全透明的無色溶血環(huán)，稱乙型溶血；還能產(chǎn)生鏈激酶（又稱溶纖維蛋白酶），激活血漿中的血漿蛋白酶原，使之變成活動性的血漿蛋白酶，故可溶解血塊或阻止血漿凝固；還可以產(chǎn)生胞外cAMP因子，它可以增強葡萄球菌的溶血能力，即增強對羊、牛血紅細胞的溶解能力。因此，在羊血瓊脂平板上接種鏈球菌處，可以見到蘑菇狀或箭頭樣的溶血區(qū)。3 實驗材料3．1設備和材料 溫箱、水浴、顯微鏡、離心機、試管架、滅菌平皿、滅菌小試管、載玻片、滅菌吸管（1mL、10mL）滅菌鑷子、均質(zhì)器、酒精燈、接種環(huán)。3．2培養(yǎng)基和試劑 葡萄糖肉浸液肉湯、牛心浸液、匹克氏肉湯、血瓊脂平板、人血漿、%氯化鈣、滅菌生理鹽水、桿菌肽藥敏紙片()。4 實驗方法與步驟：4．1溶血性鏈球菌檢驗程序（如圖311）36177。１℃檢樣25g（ml）＋225ml滅菌生理鹽水葡萄糖肉侵液肉湯或匹克氏肉湯血平板36177。１℃24h血干板（分純培養(yǎng)）36177。１℃24h24h鏈激酶試驗桿菌肽敏感試驗觀察溶血革蘭氏染色報 告圖311 溶血性鏈球菌檢驗程序4．2 樣品處理稱取25g固體檢樣或稱取25mL液體檢樣，加入225mL滅菌生理鹽水制成混懸液。4．3 一般培養(yǎng)將上述混懸液吸取5mL，接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯或直接劃線接種于血平板，如檢樣污染嚴重，可同時按上述量接種匹克氏肉湯，經(jīng)36177。1℃培養(yǎng)24h后接種血平板，置36177。1℃培養(yǎng)24h，挑取乙型溶血圓形突起的細小菌落在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌肽敏感試驗。4．4 形態(tài)與染色本菌呈球形或卵圓形，～1μm，鏈狀排列，鏈長短不一，短者4～8個細胞組成，長者20～30個，鏈的長短常與細菌的種類及生長環(huán)境有關(guān)；液體培養(yǎng)中易呈長鏈；在固體培養(yǎng)基中常呈短鏈，不形成芽孢，無鞭毛，不能運動。4．5 培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長較好。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長時，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，～，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2～4mm界限分明、無色透明的溶血圈。4．6 鏈激酶試驗致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶(即溶纖維蛋白酶)，此酶能激活正常人體血液中的血漿蛋白酶原成為血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。，再加入18～24h 36177。1℃%(如氯化鈣已潮解，%～%)，振蕩搖勻，置于36177。1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固 (凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動)。然后觀察凝固塊重新完全溶解的時間，完全溶解為陽性。若24h后不溶解即為陰性。草酸鉀人血漿配制：，再加入5mL人血混勻，經(jīng)離心沉淀吸取上清液即為草酸鉀人血漿。4．7 桿菌肽敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌液涂布于血平板上，置于36177。1℃下培養(yǎng)18～24h，如有抑菌帶出現(xiàn)即為陽性。同時用已知陽性菌株作為對照。5 實驗結(jié)果（1）溶血性鏈球菌涂片染色鏡檢為革蘭氏陽性，～1微米，鏈狀排列，鏈的長短不一，短者由4～8個菌體組成，長者達20～30個菌。液體培養(yǎng)基中易呈長鏈，固體培養(yǎng)基中常呈短鏈。（2）溶血性鏈球菌在血平板上形成的菌落為灰白色，半透明，表面光滑有乳光，～。乙型溶血性鏈球菌菌落周圍呈完全溶血，并有明顯的溶血境界。在顯微鏡低倍鏡下觀察，菌落周圍一般不能見到紅血球。乙類溶血性鏈球菌在血平板上對桿菌胎敏感，經(jīng)37℃培養(yǎng)18小時，出現(xiàn)明顯抑菌圈。6 注意事項（1）做鏈激酶實驗時注意人血漿應新鮮。（2）實驗中操作者須注意生物安全防護，實驗結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實驗材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。7 思考題（1）溶血性鏈球菌在血平板上生長時的菌落特征？（2）溶血性鏈球菌的致病力強弱與那些生物特性有關(guān)？實驗5 食品中沙門氏菌屬的檢驗1目的要求（1）學習食品中沙門氏菌屬的檢驗方法和基本原理。（2）熟悉沙門氏菌屬因子血清的使用方法。（3）了解沙門氏菌屬的生化反應及基本原理。2 基本原理沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙門氏菌的含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。為了分離與檢測食品中的沙門氏菌，對某些加工食品必須經(jīng)過前增菌處理，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于頻死狀態(tài)的沙門氏菌恢復其活力，再進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細菌受到抑制，然后再進行分離鑒定。沙門氏菌屬是一群血清學上相關(guān)的需氧，無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，能運動，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、乳糖及蔗糖，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不分解尿素，能有規(guī)律地發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)生氣體。沙門氏菌屬細菌由于不發(fā)酵乳糖，能在各種選擇性培養(yǎng)基上生成特殊形態(tài)的菌落。大腸桿菌由于發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而出現(xiàn)與沙門氏菌形態(tài)特征不同的菌落，如在SS瓊脂平板上使中性紅指示劑變紅，菌落呈紅色，借此可把沙門氏菌同大腸桿菌相區(qū)別。根據(jù)沙門氏菌屬的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質(zhì)，尿素、KCN，賴氨酸等試驗可與腸道其它菌屬相鑒別。本菌屬的所有菌種均有特殊的抗原結(jié)構(gòu)，借此也可以把它們分辨出來。3 實驗材料3．1設備和材料 天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。3．2 培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水(BP)，氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液，四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，亞硫酸鉍瓊脂(BS)，DHL瓊脂，HE瓊脂，SS瓊脂，三鐵糖瓊脂(TSI)，蛋白胨水，靛基質(zhì)試劑，KCN培養(yǎng)基，氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管，ONPG培養(yǎng)基，半固體瓊脂，緩沖葡萄糖蛋白胨水(附MR、VP試劑)，丙二酸鈉培養(yǎng)基，氧化酶試劑，革蘭氏染色液，26種(初步分型)、57種(一般分型)、144種(詳細分型)沙門氏菌因子血清。4 實驗方法與步驟4．1 沙門氏菌屬檢驗程序（如圖321）4．2 前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品均應經(jīng)過前增菌。各稱取樣品25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內(nèi)，固體食品可用均質(zhì)器，8000～10000rpm/min打碎lmin，或用研缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。于36177。1℃培養(yǎng)4h(干蛋品需培養(yǎng)18～24h)，移取10mL轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24h。同時另取10mL，加入于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36177。l℃培養(yǎng)18～24h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。各取25mL加入滅菌生理鹽水225mL，按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)于42℃培養(yǎng)24h，另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36177。l℃，培養(yǎng)18～24h。4．3 分離取增菌液一環(huán)，劃線接種于BS平板一個和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個。于36177。1℃分別培養(yǎng)18～24h(DHL、HE，SS)或40～48h(BS)。觀察各個平板上生長的菌落，沙門氏菌亞屬I、Ⅱ，Ⅳ、V和亞屬Ⅲ在各個平板上的菌落特征見表32—1。一般4h，干蛋品18～24h36177。１℃18～24h40～48h36177。１℃18～24h18～24h36177。1℃18～24h36177。1℃18～24h42℃42℃36177。１℃檢 樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25g＋BP 225ml直接增菌法：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品25g＋滅菌生理鹽水225ml，做成檢液勻液10ml＋MM(或TTB)100ml10ml+SC100ml。檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100mlBSDHL(或HE、WS、SS)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、產(chǎn)氣、H2S），蛋白胨水（靛基質(zhì)），尿素（），KCN，賴氨酸H2S+，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S+，靛基質(zhì)＋ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S－，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋/－非如左述的各種反應結(jié)果甘露醇、山梨醇沙門氏菌血清學試驗ONPG非沙門氏菌沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌報 告檢樣勻25ml＋SC100ml（或TTB）100ml圖321 沙門氏菌屬檢驗程序表321 沙門氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亞屬Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸 瓊脂產(chǎn)H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色、菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生H2S，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變色。黑色有金屬光澤。DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同，乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn)H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍綠色或藍色，中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂無色透明，產(chǎn)生H2S菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時與大腸埃希氏菌不能區(qū)別。4．4三糖鐵高層瓊脂初步鑒別挑選上述選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種到三糖鐵瓊脂斜面試管中，于