【正文】 尿酸鹽水解試驗用試管分裝馬尿酸鹽水解培養(yǎng)基，凍存?zhèn)溆?。將瓊脂平板上培養(yǎng)過夜的生長物接種于1%馬尿酸溶液中，振搖后置37℃水浴中放置2h。(:1丙酮和丁醇中)，室溫下放置2h，出現(xiàn)紫色者為陽性反應。(11) 抗生素敏感性試驗用滅菌棉拭子將預先準備好的布氏肉湯培養(yǎng)物涂布于布氏瓊脂平板。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼于平板表面。于微需氧條件37℃培養(yǎng)24h，檢查有無抑菌圈。空腸彎曲桿菌屬各個種的生化特性見表361。表361 彎曲菌屬各個種的生化特性試驗項目空腸彎曲桿菌空腸彎曲桿菌多氏亞種結腸彎曲桿菌胎兒彎曲菌胎兒亞種琢豚彎曲桿菌烏普薩拉彎曲桿菌25℃生長－+/－－+D037℃生長＋＋＋＋＋＋42℃生長＋+/－＋D＋＋硝酸鹽還原試驗＋－＋＋＋＋%Nacl耐受試驗－－－－－－硫化氫試驗（紙條法）＋＋＋＋＋＋硫化氫試驗（TSI）－－D－＋－過氧化氫酶試驗＋＋＋＋＋－氧化酶＋＋＋＋＋＋麥康凱瓊脂＋＋＋＋＋－1％甘氨酸生長試驗＋＋＋＋＋＋馬尿酸水解試驗＋＋－－－－奈啶酮酸試驗SSSRRS頭孢菌新素試驗RRRSSS注：＋：90％以上陽性；D：11－89％陽性；－：90％以上陰性 ；〔－〕：一般不生長。R為耐受，S為敏感。5 結果與報告根據(jù)生化鑒定結果表對食品中是否含有空腸彎曲菌作出鑒定并報告。6 注意事項（1）所檢樣品在室溫中放置不能超過24h，樣品在分離前需放冰箱或冷處保存。（2）配制培養(yǎng)基時，抗生素配量必須準確，分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基不能放置過久，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。7 思考題（1）空腸彎曲菌生長的條件是什么？（2）如何鑒定一種細菌是空腸彎曲菌？實驗10 食品中肉毒梭狀芽孢桿菌及肉毒毒素的檢驗1目的要求（1）了解肉毒梭狀芽孢桿菌的生長特性和產(chǎn)毒條件。（2）熟悉肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素檢驗的原理和方法。2 基本原理肉毒梭菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，在我國主要與發(fā)酵食品有關，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等。其它引起中毒的食品還有：熏制未去內(nèi)臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。肉毒梭狀芽孢桿菌屬于專性厭氧的革蘭氏陽性粗大桿菌，形成近端位的卵圓形芽孢，芽孢比繁殖體寬，使細菌呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀，在厭氧條件下產(chǎn)生劇烈的外毒素——肉毒毒素。肉毒梭狀芽孢桿菌具有4～8根周毛性鞭毛，運動遲緩；沒有莢膜。在固體培養(yǎng)基表面上，形成不正圓形，大約3mm左右的菌落。菌落半透明，表面呈顆粒狀，邊緣不整齊，界線不明顯，向外擴散，呈絨毛網(wǎng)狀，常常擴散成菌苔。在血平板上，出現(xiàn)與菌落幾乎等大或者較大的溶血環(huán)。在乳糖卵黃牛奶平板上，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，常常在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。在庖肉培養(yǎng)基中生長時，混濁、產(chǎn)氣、發(fā)散奇臭，有的能消化肉渣。肉毒梭菌的致病性在于所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素即肉毒毒素，而細菌本身則是一種腐生菌。這些毒素能引起人和動物的肉毒中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（2）、D、E、F、G等七個型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道。各個型的肉毒梭菌分別產(chǎn)生相應的毒素，所以，肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等七個型。C型包括CC2二個亞型。A型毒素經(jīng)60℃，2min加熱，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經(jīng)70℃, 2min才能被破壞；C、D二型毒素對熱的抵抗更大些；C型毒素要經(jīng)過90℃, 2min加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1min或75℃加熱5～10min，毒素都能被完全破壞。肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細菌毒素食物中毒。肉毒梭菌生長和產(chǎn)毒的最適溫度是25~30℃，而在人的體溫條件下細菌表現(xiàn)為絲狀，幾乎不能產(chǎn)毒、芽孢也不會發(fā)芽。3 實驗材料3．1 樣品 罐頭、臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等發(fā)酵食品。3．2 菌種 肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botuLinum）。3．3 培養(yǎng)基與試劑 庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液、肉毒分型抗毒素診斷血清、胰酶（活力1：250）、革蘭氏染色液。3．4 其他 離心機、均質(zhì)器、厭氧培養(yǎng)裝置、小白鼠等。4 實驗方法與步驟4．1 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗程序(如圖371)4．2肉毒毒素的檢出肉毒中毒的診斷，重要的是毒素的檢出及定型；罐頭食品的細菌學檢驗，有時需要證實肉毒梭菌的存在，不過，最終還是要根據(jù)產(chǎn)毒試驗來鑒定細菌及其型別。（1）初步的定性試驗小白鼠腹腔注射法液狀檢樣可直接離心，固體或半固體檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后離心，取上清液進行檢測。另取一部分上清液，調(diào)pH6．2，每9份加10％胰酶(活力1：250)水溶液一份，混勻，經(jīng)常輕輕攪動，37℃作用60min，進行檢測。肉毒毒素檢測以小白鼠腹腔注射法為標準方法。檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2只，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病、死亡。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟、呼吸困難、呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛如峰腰，最終死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時，則可將注射液做適當稀釋，重新試驗。（2）確證試驗不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成3份進行試驗。1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min；1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2只，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有癥狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時進行毒力測定及定型試驗。檢樣（食品）毒素檢測增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng)（30℃，5d）報告觀察生長形狀，染色毒素報告分離培養(yǎng)觀察菌落性狀，染色鏡檢增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)30℃，5d毒素培養(yǎng)報告圖371 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗程序（3）毒力測定取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5 000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2只，每只0．5mL，觀察4d。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣中所含肉毒毒素的大體毒力(MLD／mL或MLD／g)。例如，5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡，而注射5 000倍稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1 000～10000LD／mL。（4 ）定型試驗按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1 000 LD／mL的范圍，分別與各單型肉毒抗毒診斷血清等量混勻，37℃作用30 min，各注射小白鼠2只，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。（5）結果分析食物中發(fā)現(xiàn)毒素，表明未經(jīng)充分的加熱處理，可能引起肉毒中毒。檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會引起肉毒中毒。肉毒中毒的診斷必須以檢出食物中的肉毒毒素為準。4．3 肉毒梭菌的檢驗與分離鑒定肉毒梭菌檢驗方法的重點乃是產(chǎn)毒及毒素的檢出試驗，如要證實是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。（1）肉毒梭菌檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗）取皰肉培養(yǎng)基3支，煮沸10~15min做如下處理：第1支急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1~2mL；第2支冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min后急速冷卻；第3支接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min 后急速冷卻。以上接種物于30℃培養(yǎng)5d，若無生長，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，陽性結果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。（2）分離培養(yǎng)選取經(jīng)毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時可重復一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋特有的虹彩樣（或珍珠層樣）薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種皰肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d，進行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗。毒素檢測：培養(yǎng)特征檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48h，觀察生長情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長并形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。5 實驗結果詳細記錄實驗過程和現(xiàn)象，判斷樣品中是否含有肉毒梭狀芽孢桿菌。6 注意事項（1）典型的肉毒中毒，小白鼠會在4~6h內(nèi)死亡，而且98～99%的小白鼠會在12h內(nèi)死亡，因此，試驗前24h內(nèi)的觀察是非常重要的。24小時后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。（2）如果小白鼠注射經(jīng)1：2或1：5倍數(shù)稀釋的樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是非?？梢傻默F(xiàn)象，一般為非特異性死亡。（3）小白鼠要用不會抹去的顏料加以標記。小白鼠的飼料與水必須及時添加、充分供應。7 思考題（1）在食品中檢出肉毒梭狀芽孢桿菌，能否說明食物可引起食物中毒？（2）在食品中檢測肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素的過程中，應注意那些事項？實驗11 食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗1 目的要求（1）了解單核細胞增生李斯特氏菌的生物學特性。（2）熟悉單核細胞增生李斯特氏菌的分離鑒定方法。2 基本原理單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青貯飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔糞便的途徑進行傳播。據(jù)報道，～16%，有70%的人可短期帶菌，4～8%的水產(chǎn)品、5～10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單核細胞增生李斯特氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為（～）μm（～）μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落?！　≡摼鸂I養(yǎng)要求不高，在20～25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2～5d可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。該菌的生長范圍為2～42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35～37℃，在pH中性至弱堿性（）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，～，% NaCl 肉湯中生長良好。在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5～7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)瓊脂上，用450角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。在科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天就可見蘭色菌落。3 實驗材料3．1菌種 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。3．2 食品 雞肉、生牛排、鮮牛奶、芹菜。3．3培養(yǎng)基 EB增菌液、TSAYE培養(yǎng)基、MMA培養(yǎng)基、硫酸鐵銨半固體（SIM）。3．4其他 均質(zhì)器、顯微鏡、小鼠。4 實驗方法與步驟4．1 單核細胞增生李斯特菌的檢測程序（圖381）4．2 增菌培養(yǎng)取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進行均質(zhì)，然后轉入三角瓶中，30℃培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。4．3 分離共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在MMA瓊脂平板、科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基平板上劃線，置于30℃培養(yǎng)48h，然后，把MMA平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在MMA平板上呈有光澤的蘭色或灰色的小的圓形菌落。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。在MMA平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在MMA平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是一個樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24～48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。4．4鑒定（1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。30℃，24h25℃ 2～5d