【正文】 尿酸鹽水解試驗(yàn)用試管分裝馬尿酸鹽水解培養(yǎng)基，凍存?zhèn)溆?。將瓊脂平板上培養(yǎng)過夜的生長(zhǎng)物接種于1%馬尿酸溶液中，振搖后置37℃水浴中放置2h。(:1丙酮和丁醇中)，室溫下放置2h，出現(xiàn)紫色者為陽(yáng)性反應(yīng)。(11) 抗生素敏感性試驗(yàn)用滅菌棉拭子將預(yù)先準(zhǔn)備好的布氏肉湯培養(yǎng)物涂布于布氏瓊脂平板。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼于平板表面。于微需氧條件37℃培養(yǎng)24h，檢查有無(wú)抑菌圈。空腸彎曲桿菌屬各個(gè)種的生化特性見表361。表361 彎曲菌屬各個(gè)種的生化特性試驗(yàn)項(xiàng)目空腸彎曲桿菌空腸彎曲桿菌多氏亞種結(jié)腸彎曲桿菌胎兒彎曲菌胎兒亞種琢豚彎曲桿菌烏普薩拉彎曲桿菌25℃生長(zhǎng)－+/－－+D037℃生長(zhǎng)＋＋＋＋＋＋42℃生長(zhǎng)＋+/－＋D＋＋硝酸鹽還原試驗(yàn)＋－＋＋＋＋%Nacl耐受試驗(yàn)－－－－－－硫化氫試驗(yàn)（紙條法）＋＋＋＋＋＋硫化氫試驗(yàn)（TSI）－－D－＋－過氧化氫酶試驗(yàn)＋＋＋＋＋－氧化酶＋＋＋＋＋＋麥康凱瓊脂＋＋＋＋＋－1％甘氨酸生長(zhǎng)試驗(yàn)＋＋＋＋＋＋馬尿酸水解試驗(yàn)＋＋－－－－奈啶酮酸試驗(yàn)SSSRRS頭孢菌新素試驗(yàn)RRRSSS注：＋：90％以上陽(yáng)性；D：11－89％陽(yáng)性；－：90％以上陰性 ；〔－〕：一般不生長(zhǎng)。R為耐受，S為敏感。5 結(jié)果與報(bào)告根據(jù)生化鑒定結(jié)果表對(duì)食品中是否含有空腸彎曲菌作出鑒定并報(bào)告。6 注意事項(xiàng)（1）所檢樣品在室溫中放置不能超過24h，樣品在分離前需放冰箱或冷處保存。（2）配制培養(yǎng)基時(shí)，抗生素配量必須準(zhǔn)確，分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基不能放置過久，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。7 思考題（1）空腸彎曲菌生長(zhǎng)的條件是什么？（2）如何鑒定一種細(xì)菌是空腸彎曲菌？實(shí)驗(yàn)10 食品中肉毒梭狀芽孢桿菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)1目的要求（1）了解肉毒梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)毒條件。（2）熟悉肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素檢驗(yàn)的原理和方法。2 基本原理肉毒梭菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國(guó)以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，在我國(guó)主要與發(fā)酵食品有關(guān)，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等。其它引起中毒的食品還有：熏制未去內(nèi)臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。肉毒梭狀芽孢桿菌屬于專性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，形成近端位的卵圓形芽孢，芽孢比繁殖體寬，使細(xì)菌呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀，在厭氧條件下產(chǎn)生劇烈的外毒素——肉毒毒素。肉毒梭狀芽孢桿菌具有4～8根周毛性鞭毛，運(yùn)動(dòng)遲緩；沒有莢膜。在固體培養(yǎng)基表面上，形成不正圓形，大約3mm左右的菌落。菌落半透明，表面呈顆粒狀，邊緣不整齊，界線不明顯，向外擴(kuò)散，呈絨毛網(wǎng)狀，常常擴(kuò)散成菌苔。在血平板上，出現(xiàn)與菌落幾乎等大或者較大的溶血環(huán)。在乳糖卵黃牛奶平板上，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，常常在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。在庖肉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，混濁、產(chǎn)氣、發(fā)散奇臭，有的能消化肉渣。肉毒梭菌的致病性在于所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素即肉毒毒素，而細(xì)菌本身則是一種腐生菌。這些毒素能引起人和動(dòng)物的肉毒中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（2）、D、E、F、G等七個(gè)型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報(bào)道。各個(gè)型的肉毒梭菌分別產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，所以，肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等七個(gè)型。C型包括CC2二個(gè)亞型。A型毒素經(jīng)60℃，2min加熱，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經(jīng)70℃, 2min才能被破壞；C、D二型毒素對(duì)熱的抵抗更大些；C型毒素要經(jīng)過90℃, 2min加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1min或75℃加熱5～10min，毒素都能被完全破壞。肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細(xì)菌毒素食物中毒。肉毒梭菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的最適溫度是25~30℃，而在人的體溫條件下細(xì)菌表現(xiàn)為絲狀，幾乎不能產(chǎn)毒、芽孢也不會(huì)發(fā)芽。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1 樣品 罐頭、臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等發(fā)酵食品。3．2 菌種 肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botuLinum）。3．3 培養(yǎng)基與試劑 庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液、肉毒分型抗毒素診斷血清、胰酶（活力1：250）、革蘭氏染色液。3．4 其他 離心機(jī)、均質(zhì)器、厭氧培養(yǎng)裝置、小白鼠等。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗(yàn)程序(如圖371)4．2肉毒毒素的檢出肉毒中毒的診斷，重要的是毒素的檢出及定型；罐頭食品的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，有時(shí)需要證實(shí)肉毒梭菌的存在，不過，最終還是要根據(jù)產(chǎn)毒試驗(yàn)來(lái)鑒定細(xì)菌及其型別。（1）初步的定性試驗(yàn)小白鼠腹腔注射法液狀檢樣可直接離心，固體或半固體檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。另取一部分上清液，調(diào)pH6．2，每9份加10％胰酶(活力1：250)水溶液一份，混勻，經(jīng)常輕輕攪動(dòng)，37℃作用60min，進(jìn)行檢測(cè)。肉毒毒素檢測(cè)以小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。檢出試驗(yàn)：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2只，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病、死亡。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟、呼吸困難、呼吸呈風(fēng)箱式，腰部凹陷，宛如峰腰，最終死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時(shí)，則可將注射液做適當(dāng)稀釋，重新試驗(yàn)。（2）確證試驗(yàn)不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成3份進(jìn)行試驗(yàn)。1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min；1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2只，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護(hù)存活，而唯有注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有癥狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時(shí)進(jìn)行毒力測(cè)定及定型試驗(yàn)。檢樣（食品）毒素檢測(cè)增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng)（30℃，5d）報(bào)告觀察生長(zhǎng)形狀，染色毒素報(bào)告分離培養(yǎng)觀察菌落性狀，染色鏡檢增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)30℃，5d毒素培養(yǎng)報(bào)告圖371 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗(yàn)程序（3）毒力測(cè)定取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5 000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2只，每只0．5mL，觀察4d。根據(jù)動(dòng)物死亡情況，計(jì)算檢樣中所含肉毒毒素的大體毒力(MLD／mL或MLD／g)。例如，5倍、50倍及500倍稀釋致動(dòng)物全部死亡，而注射5 000倍稀釋液的動(dòng)物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1 000～10000LD／mL。（4 ）定型試驗(yàn)按毒力測(cè)定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1 000 LD／mL的范圍，分別與各單型肉毒抗毒診斷血清等量混勻，37℃作用30 min，各注射小白鼠2只，觀察4d。同時(shí)以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對(duì)照。能保護(hù)動(dòng)物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。（5）結(jié)果分析食物中發(fā)現(xiàn)毒素，表明未經(jīng)充分的加熱處理，可能引起肉毒中毒。檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會(huì)引起肉毒中毒。肉毒中毒的診斷必須以檢出食物中的肉毒毒素為準(zhǔn)。4．3 肉毒梭菌的檢驗(yàn)與分離鑒定肉毒梭菌檢驗(yàn)方法的重點(diǎn)乃是產(chǎn)毒及毒素的檢出試驗(yàn)，如要證實(shí)是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。（1）肉毒梭菌檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗(yàn)）取皰肉培養(yǎng)基3支，煮沸10~15min做如下處理：第1支急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1~2mL；第2支冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min后急速冷卻；第3支接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min 后急速冷卻。以上接種物于30℃培養(yǎng)5d，若無(wú)生長(zhǎng)，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長(zhǎng)，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測(cè)試驗(yàn)，陽(yáng)性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。（2）分離培養(yǎng)選取經(jīng)毒素檢測(cè)試驗(yàn)證實(shí)含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時(shí)可重復(fù)一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋特有的虹彩樣（或珍珠層樣）薄層，但G型菌無(wú)此現(xiàn)象。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種皰肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d，進(jìn)行毒素檢測(cè)及培養(yǎng)特性檢查確證試驗(yàn)。毒素檢測(cè)：培養(yǎng)特征檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48h，觀察生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長(zhǎng)并形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長(zhǎng)。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程和現(xiàn)象，判斷樣品中是否含有肉毒梭狀芽孢桿菌。6 注意事項(xiàng)（1）典型的肉毒中毒，小白鼠會(huì)在4~6h內(nèi)死亡，而且98～99%的小白鼠會(huì)在12h內(nèi)死亡，因此，試驗(yàn)前24h內(nèi)的觀察是非常重要的。24小時(shí)后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。（2）如果小白鼠注射經(jīng)1：2或1：5倍數(shù)稀釋的樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是非常可疑的現(xiàn)象，一般為非特異性死亡。（3）小白鼠要用不會(huì)抹去的顏料加以標(biāo)記。小白鼠的飼料與水必須及時(shí)添加、充分供應(yīng)。7 思考題（1）在食品中檢出肉毒梭狀芽孢桿菌，能否說明食物可引起食物中毒？（2）在食品中檢測(cè)肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素的過程中，應(yīng)注意那些事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)11 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)1 目的要求（1）了解單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性。（2）熟悉單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的分離鑒定方法。2 基本原理單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青貯飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動(dòng)物很容易食入該菌，并通過口腔糞便的途徑進(jìn)行傳播。據(jù)報(bào)道，～16%，有70%的人可短期帶菌，4～8%的水產(chǎn)品、5～10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小約為（～）μm（～）μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無(wú)芽孢，一般不形成莢膜，但在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。　　該菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在20～25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2～5d可見倒立傘狀生長(zhǎng)，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動(dòng)。該菌的生長(zhǎng)范圍為2～42℃（也有報(bào)道在0℃能緩慢生長(zhǎng)），最適培養(yǎng)溫度為35～37℃，在pH中性至弱堿性（）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長(zhǎng)良好，～，% NaCl 肉湯中生長(zhǎng)良好。在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5～7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)瓊脂上，用450角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。在科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天就可見蘭色菌落。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1菌種 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。3．2 食品 雞肉、生牛排、鮮牛奶、芹菜。3．3培養(yǎng)基 EB增菌液、TSAYE培養(yǎng)基、MMA培養(yǎng)基、硫酸鐵銨半固體（SIM）。3．4其他 均質(zhì)器、顯微鏡、小鼠。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)程序（圖381）4．2 增菌培養(yǎng)取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無(wú)選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中，30℃培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。4．3 分離共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在MMA瓊脂平板、科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基平板上劃線，置于30℃培養(yǎng)48h，然后，把MMA平板放于解剖鏡載物臺(tái)上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在MMA平板上呈有光澤的蘭色或灰色的小的圓形菌落。用已知陽(yáng)性菌和陰性菌劃線的平板作對(duì)照。在MMA平板上挑取5個(gè)或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個(gè)菌落。食品檢驗(yàn)中在TSAYE平板上純化是必須的，因?yàn)樵贛MA平板上分離菌落時(shí)可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24～48h，如果不用于動(dòng)力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。4．4鑒定（1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對(duì)照。30℃，24h25℃ 2～5d