【正文】 食品微生物學(xué)實驗技術(shù)實驗1 食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測定1 目的要求（1）掌握食品中菌落總數(shù)測定方法。（2）了解食品清潔程度（被污染程度）及觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，從而為被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。2 基本原理菌落（colony）是指細(xì)菌在某一種固體培養(yǎng)基上克隆增殖發(fā)育成肉眼可見的細(xì)菌集團。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)成分，培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（g，cm2)檢樣中所含菌落總數(shù)。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。菌落總數(shù)是作為判定食品的清潔程度（被污染程度）的標(biāo)記，通常越干凈的食品，單位樣品菌落總數(shù)越低。反之，菌落總數(shù)就越高。菌落總數(shù)的測定是以每個活細(xì)菌能克隆增殖形成一個可見的單獨菌落為基礎(chǔ)的，但是在實踐中除了單個細(xì)胞形成菌落外，二個或兩個以上相連的同種細(xì)胞也同樣可形成菌落，所以現(xiàn)在均以菌落總數(shù)（而不是活細(xì)菌數(shù)）或菌落形成單位數(shù)表達。由于菌落總數(shù)的測定是在37℃有氧條件下培養(yǎng)的結(jié)果，對于厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜熱菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌也受到限制。因此，這種方法所得到的結(jié)果，實際上只包括一群在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。但由于在自然界這類細(xì)菌占大多數(shù)，其數(shù)量的多少能反映出樣品中細(xì)菌的總數(shù)，正因為如此，用該方法來測定食品中含有的細(xì)菌總數(shù)已得到了廣泛的認(rèn)可。3 實驗材料3．1 儀器 恒溫箱、冰箱、恒溫水浴鍋、天平、微波爐、均質(zhì)器。3．2 材料 吸管（、1m和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、滅菌平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、滅菌鑷子。3．3 試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、75%乙醇、%生理鹽水。4 實驗方法與步驟 4．1 菌落總數(shù)實驗程序（如圖281）4．2 檢樣稀釋及培養(yǎng)（1）以無菌操作將檢樣25g(25mL)剪碎放于裝有225mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶內(nèi)，經(jīng)過充分振蕩或均質(zhì)處理制作成1：10的均勻稀釋液（固體食品有的需先用滅菌研缽研磨后再稀釋）。（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管混合均勻，作成1：100稀釋液，按上述操作順序，作10倍系列稀釋液，每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。（3）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋液，分別在作10倍遞增稀釋同時，吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。（4）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將融化并冷卻到46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入加有無菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。（5）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2hr（肉、乳和蛋品為48+2h，水產(chǎn)為30℃48+2h）。48+2h36+1℃檢樣做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇2～3個適宜稀釋度，各以1ml量加入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量營養(yǎng)瓊脂菌落計數(shù)結(jié)果圖281 菌落總數(shù)實驗程序4．3 菌落計數(shù) 將培養(yǎng)24h后的平板取出，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)，一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板的平均數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（或毫升）樣品所含菌落總數(shù)。4．4 平板菌落計數(shù)方法(1) 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)，且一個稀釋度應(yīng)使用兩個平板的平均數(shù)。其中當(dāng)一個平板有較大片狀菌落生長時，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。(2) 稀釋度的選擇A．應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。B．若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300個之間，則視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若兩者之比大于2，則報告其中較小的數(shù)字。C．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。D．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最底的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。E．若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。F．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。(3) 菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。(見表281)表281 稀釋度選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g，mL）報告方式（cfu/g，mL）1011021031多不可計164201640001042多不可計295461．6377501043多不可計271602．2271001044多不可計多不可計3133130001055271152701026000110107多不可計30512305001045 實驗結(jié)果（1）將實驗得到的菌落總數(shù)結(jié)果記入下表102103104105備注12平均（2）報告所選兩個稀釋度之比及檢測結(jié)果。6 注意事項（1）若實驗樣品為食品，為防止食品碎屑混入瓊脂影響計數(shù)，通常需在瓊脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，%TTC，培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。（2）理論上講，為了得到實驗食品中所有細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將樣品接種到幾種不同的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)在不同的條件下，所得到的細(xì)菌菌落數(shù)總和。但根據(jù)國家頒發(fā)的不同食品的規(guī)定，都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂，37℃（水產(chǎn)品30℃）進行需氧培養(yǎng)的結(jié)果來確定的，而且這種測定確具代表性，因而菌落總數(shù)在一般衛(wèi)生學(xué)評價中并不要求用不同培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。（3）目前還有幾種快速檢測菌落總數(shù)的方法如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制而成食品細(xì)菌檢驗箱，菌落總數(shù)測定采用試管斜面計數(shù)法操作簡便，不易受污染，結(jié)果與國標(biāo)法平板計數(shù)一致。另一種是3M有限公司提供的Petrifilm Plates測試片（菌落總數(shù)測試片）。由于測試片中含有一種紅色指示劑，使所有菌落易于識別計數(shù)，該片也可用于乳酸菌測定，48hr可確定菌落總數(shù)。7 思考題（1）什么是菌落總數(shù)，何謂cfu？（2）若平板上菌落數(shù)生長一半較均勻，另一半呈片生長，如何計數(shù)菌落數(shù)？（3）影響雜菌總數(shù)準(zhǔn)確性的因素有哪些？實驗2 食品中大腸菌群的測定1 目的要求（1）學(xué)習(xí)與掌握食品中大腸菌群的測定方法。（2）了解大腸菌群在食品衛(wèi)生學(xué)檢驗中的意義。2 基本原理大腸菌群系指一群在37℃24hr能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的埃希氏無芽孢桿菌。它包括大腸埃希氏桿菌和檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌等類大腸桿菌。大腸菌群的檢測就是根據(jù)大腸菌群的定義，即利用它們能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性而設(shè)計的初發(fā)酵實驗；初發(fā)酵陽性管通過伊紅美蘭平板進行分離；復(fù)發(fā)酵對分離菌作證實實驗的三步法。根據(jù)證實為大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的最可能數(shù)（食品中大腸菌群系以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN表示），MPN最可能數(shù)是表示樣品中活菌密度的估計。3 實驗材料3．1 儀器 溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、微波爐、均質(zhì)器、普通光學(xué)顯微鏡。3．2 材料 吸管（、1mL和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、鑷子、小倒管等。3．3 培養(yǎng)基 乳糖膽鹽培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，革蘭氏染色液，%生理鹽水。4 實驗方法與步驟4．1 大腸菌群檢驗程序（如圖291）4．2 檢樣稀釋取檢樣25g(mL)剪碎，以225mL滅菌生理鹽水稀釋做成1:10稀釋液，并依次做10倍遞增稀釋液，例如101，102，103，104等，估計樣品污染程度，選擇3個合適稀釋液備用。4．3 乳糖發(fā)酵試驗將待稀釋檢樣品接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，可報告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。4．4 分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管劃線接種在伊紅美蘭瓊脂平板上，36+1℃溫箱內(nèi)18～24h培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。典型的大腸埃希氏菌落呈紫黑色金屬光澤，非典型大腸菌群有時為紅色菌落。4．5 證實試驗在上述平板上，挑取帶有黑色金屬光澤的可疑大腸菌群菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管36+1℃培養(yǎng)24+2h后觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色陰性的無芽孢桿菌即可報告為大腸菌群陽性。檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管(36+1℃,24+2h)不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報 告產(chǎn) 氣伊紅美蘭瓊脂平板(36+1℃,24+2h) ↓ (24+2h,36+1℃)革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管(36+1℃,24+2h)革蘭氏染色陽性革蘭氏陰性無芽胞桿菌產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報 告大腸桿菌陽性報 告大腸菌群陰性報 告圖291 大腸菌群檢驗程序5 實驗結(jié)果（1）將大腸菌群檢驗結(jié)果填入下表接種量管號發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復(fù)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論+或1mL123123123（2）根據(jù)證實為大腸菌群的陽性管數(shù)，查（MPN檢索表后報告每100mL (g)大腸菌群的最可能數(shù)。6 注意事項雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實試驗用。（1）初發(fā)酵實驗與證實實驗有時不一定符合。凡初發(fā)酵的產(chǎn)氣管一定要做伊紅美蘭平板分離。如果平板出現(xiàn)典型的大腸菌菌落，G染色陰性無芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，應(yīng)多挑取菌落包括挑菌落中心黑紅、灰紅，以及紅、粉紅等菌落，在革蘭氏染色的同時，做證實試驗，以免出現(xiàn)假陰性。（2）關(guān)于產(chǎn)氣 發(fā)酵管內(nèi)的小倒管如儲留氣體則是陽性結(jié)果，如果不存留氣體，但液面及管壁可以看到緩慢上浮的小氣泡，或者對沒有氣體產(chǎn)生的發(fā)酵管用手輕輕彈動試管，有氣泡出現(xiàn)而且沿管壁上升，都應(yīng)考慮可能是由菌發(fā)酵產(chǎn)生氣體的緣故。應(yīng)做進一步觀察，因為這種情況陽性檢出率可達50%以上。（3）所謂典型大腸埃希氏菌是指具有該菌所有生物學(xué)特性的大腸菌。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類型。所以如查出多量典型大腸埃希氏菌表明樣品是糞便的近期污染結(jié)果。研究表明，典型大腸菌隨糞便排到外界環(huán)境中約一周后，典型菌可變?yōu)榉堑湫途＿@種變化以生化變異為主。如果樣品檢測以非典型大腸菌為主，則指示樣品受糞便的遠(yuǎn)期污染。大腸埃希氏菌大量存在于人畜腸道，并隨糞便排出。本菌在糞便中數(shù)量多，易于培養(yǎng)，對外界的抵抗力與腸道致病菌比較相近，所以選擇大腸埃希氏菌作為被糞便污染的指示菌，合理、科學(xué)。凡被糞便污染的樣品，就有可能受到致病菌污染。所以大腸菌群的測定是必做的食品衛(wèi)生學(xué)檢項目。（4）大腸菌群檢驗方法（國標(biāo)）采用的管發(fā)酵通常需三天，目前已開發(fā)出幾種快速檢驗方法（TTC顯色法，DC試管法，紙片法）。如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院研制而成的一小時快速檢測法，檢驗結(jié)果與國標(biāo)法一致。3M中國有限公司提供的petrifilm plates測試片，可在２４小時確定大腸菌群數(shù)。7 思考題（1）什么是大腸菌群？大腸菌群表示的單位及其意義。（2）固體檢樣三個稀釋度檢測結(jié)果都是陰性時，MPN怎樣表示？（3）液體檢樣三個稀釋度檢測結(jié)果都是陰性時，MPN怎樣表示？（4）大腸菌群檢驗中為什么首先要用乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵？實驗3 食品中金黃色葡萄球菌的檢測1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢測方法。（2）觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板和BairdParker氏瓊脂平板上生長的菌落特征。（3）觀察金黃色葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶現(xiàn)象。2 基本原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。在血平板上生長時，因產(chǎn)生金黃色色素使菌落呈金黃色；由于產(chǎn)生溶血素使菌落周圍形成大而透明的溶血圈。在BairdParker氏平板上生長時，因?qū)嗧谒徕涍€原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產(chǎn)生脂酶使菌落周圍有一渾濁帶，而在其外層因產(chǎn)生蛋白水解酶有一透明帶。在肉湯中生長時，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養(yǎng)基中（叫做游離凝固酶）。此酶類似凝血酶原物質(zhì)，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變成固態(tài)纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態(tài)。3 實驗材料3．1儀器和材料 顯微鏡、溫箱、離心機、滅菌吸管（1mL，10mL）、滅菌試管、滅菌平皿、均質(zhì)器、載玻片、L型涂布棒、酒精燈、接種環(huán)。3．2 培養(yǎng)基及試劑 胰酪胨大豆肉湯、%氯化鈉肉湯、豆粉瓊脂、血瓊脂平板、BairdParker瓊脂平板、肉浸液肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液等。