【正文】 致病性葡萄球菌菌體較小，～1μm。4實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序（如圖301）　　24h36+1℃24h36+1℃24h36+1℃24h36+1℃檢樣25g(ml)+225ml滅菌生理鹽水直接記數(shù)方法增菌培養(yǎng)方法、%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯血 平 板血平板，BairdParker平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào) 告圖301 金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序4．2 增菌培養(yǎng)法（1）檢樣處理稱取25g固體樣品或吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。在肉湯中生長(zhǎng)時(shí)，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養(yǎng)基中（叫做游離凝固酶）。（3）觀察金黃色葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶現(xiàn)象。3M中國(guó)有限公司提供的petrifilm plates測(cè)試片，可在２４小時(shí)確定大腸菌群數(shù)。凡被糞便污染的樣品，就有可能受到致病菌污染。這種變化以生化變異為主。（3）所謂典型大腸埃希氏菌是指具有該菌所有生物學(xué)特性的大腸菌。如果平板出現(xiàn)典型的大腸菌菌落，G染色陰性無芽孢菌，即可做出判定。6 注意事項(xiàng)雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。典型的大腸埃希氏菌落呈紫黑色金屬光澤，非典型大腸菌群有時(shí)為紅色菌落。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1 大腸菌群檢驗(yàn)程序（如圖291）4．2 檢樣稀釋取檢樣25g(mL)剪碎，以225mL滅菌生理鹽水稀釋做成1:10稀釋液，并依次做10倍遞增稀釋液，例如101，102，103，104等，估計(jì)樣品污染程度，選擇3個(gè)合適稀釋液備用。根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的最可能數(shù)（食品中大腸菌群系以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN表示），MPN最可能數(shù)是表示樣品中活菌密度的估計(jì)。（2）了解大腸菌群在食品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)中的意義。（3）目前還有幾種快速檢測(cè)菌落總數(shù)的方法如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制而成食品細(xì)菌檢驗(yàn)箱，菌落總數(shù)測(cè)定采用試管斜面計(jì)數(shù)法操作簡(jiǎn)便，不易受污染，結(jié)果與國(guó)標(biāo)法平板計(jì)數(shù)一致。(見表281)表281 稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g，mL）報(bào)告方式（cfu/g，mL）1011021031多不可計(jì)164201640001042多不可計(jì)295461．6377501043多不可計(jì)271602．2271001044多不可計(jì)多不可計(jì)3133130001055271152701026000110107多不可計(jì)30512305001045 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）將實(shí)驗(yàn)得到的菌落總數(shù)結(jié)果記入下表102103104105備注12平均（2）報(bào)告所選兩個(gè)稀釋度之比及檢測(cè)結(jié)果。D．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最底的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。其中當(dāng)一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。（4）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將融化并冷卻到46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入加有無菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。3．3 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、75%乙醇、%生理鹽水。因此，這種方法所得到的結(jié)果，實(shí)際上只包括一群在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)是作為判定食品的清潔程度（被污染程度）的標(biāo)記，通常越干凈的食品，單位樣品菌落總數(shù)越低。（2）了解食品清潔程度（被污染程度）及觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，從而為被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。2 基本原理菌落（colony）是指細(xì)菌在某一種固體培養(yǎng)基上克隆增殖發(fā)育成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。反之，菌落總數(shù)就越高。但由于在自然界這類細(xì)菌占大多數(shù)，其數(shù)量的多少能反映出樣品中細(xì)菌的總數(shù)，正因?yàn)槿绱耍迷摲椒▉頊y(cè)定食品中含有的細(xì)菌總數(shù)已得到了廣泛的認(rèn)可。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟 4．1 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)程序（如圖281）4．2 檢樣稀釋及培養(yǎng)（1）以無菌操作將檢樣25g(25mL)剪碎放于裝有225mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，經(jīng)過充分振蕩或均質(zhì)處理制作成1：10的均勻稀釋液（固體食品有的需先用滅菌研缽研磨后再稀釋）。（5）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2hr（肉、乳和蛋品為48+2h，水產(chǎn)為30℃48+2h）。(2) 稀釋度的選擇A．應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。E．若所有稀釋度均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。6 注意事項(xiàng)（1）若實(shí)驗(yàn)樣品為食品，為防止食品碎屑混入瓊脂影響計(jì)數(shù)，通常需在瓊脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，%TTC，培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。另一種是3M有限公司提供的Petrifilm Plates測(cè)試片（菌落總數(shù)測(cè)試片）。2 基本原理大腸菌群系指一群在37℃24hr能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的埃希氏無芽孢桿菌。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1 儀器 溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、微波爐、均質(zhì)器、普通光學(xué)顯微鏡。4．3 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待稀釋檢樣品接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，可報(bào)告為大腸菌群陰性。4．5 證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取帶有黑色金屬光澤的可疑大腸菌群菌落1～2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36+1℃培養(yǎng)24+2h后觀察產(chǎn)氣情況。30mL和10mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗(yàn)用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。如果平板上典型菌落少，應(yīng)多挑取菌落包括挑菌落中心黑紅、灰紅，以及紅、粉紅等菌落，在革蘭氏染色的同時(shí)，做證實(shí)試驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陰性。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類型。如果樣品檢測(cè)以非典型大腸菌為主，則指示樣品受糞便的遠(yuǎn)期污染。所以大腸菌群的測(cè)定是必做的食品衛(wèi)生學(xué)檢項(xiàng)目。7 思考題（1）什么是大腸菌群？大腸菌群表示的單位及其意義。2 基本原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。此酶類似凝血酶原物質(zhì)，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變成固態(tài)纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態(tài)。（2）增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36177。（4）培養(yǎng)特征在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。（5）血漿凝固酶試驗(yàn)吸取1∶，放入小試管中，振蕩搖勻，放36177。如水分不多吸收，可將平板放在36177。1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。在中毒食品、膿汁或液體培養(yǎng)基中常呈單個(gè)或環(huán)球短鏈排列，易誤認(rèn)為鏈球菌或細(xì)球菌。（2）實(shí)驗(yàn)中操作者須注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實(shí)驗(yàn)材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。2 基本原理乙型（β）溶血性鏈球菌致病性強(qiáng)，能產(chǎn)生溶血毒素，在血平板上生長(zhǎng)，可使菌落周圍形成一個(gè)有2～4mm寬，界限分明，完全透明的無色溶血環(huán)，稱乙型溶血；還能產(chǎn)生鏈激酶（又稱溶纖維蛋白酶），激活血漿中的血漿蛋白酶原，使之變成活動(dòng)性的血漿蛋白酶，故可溶解血塊或阻止血漿凝固；還可以產(chǎn)生胞外cAMP因子，它可以增強(qiáng)葡萄球菌的溶血能力，即增強(qiáng)對(duì)羊、牛血紅細(xì)胞的溶解能力。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟：4．1溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序（如圖311）36177。4．3 一般培養(yǎng)將上述混懸液吸取5mL，接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯或直接劃線接種于血平板，如檢樣污染嚴(yán)重，可同時(shí)按上述量接種匹克氏肉湯，經(jīng)36177。4．5 培養(yǎng)特性該菌營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好。，再加入18～24h 36177。若24h后不溶解即為陰性。同時(shí)用已知陽性菌株作為對(duì)照。乙型溶血性鏈球菌菌落周圍呈完全溶血，并有明顯的溶血境界。（2）實(shí)驗(yàn)中操作者須注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實(shí)驗(yàn)材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。2 基本原理沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動(dòng)物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。沙門氏菌屬細(xì)菌由于不發(fā)酵乳糖，能在各種選擇性培養(yǎng)基上生成特殊形態(tài)的菌落。3 實(shí)驗(yàn)材料3．1設(shè)備和材料 天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細(xì)吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。各稱取樣品25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶?jī)?nèi)，固體食品可用均質(zhì)器，8000～10000rpm/min打碎lmin，或用研缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。l℃培養(yǎng)18～24h。4．3 分離取增菌液一環(huán)，劃線接種于BS平板一個(gè)和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個(gè)。一般4h，干蛋品18～24h36177。1℃18～24h42℃42℃36177。DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂無色透明，產(chǎn)生H2S菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯。表322 腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣H2S可能的菌屬－＋＋/－＋沙門氏菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、愛德華氏菌屬＋＋＋/－＋沙門氏菌屬亞屬Ⅲ、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬－＋＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬該表說明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時(shí)H2S陰性的菌株可以排除，其它的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時(shí)也均有不是沙門氏菌的可能。按反應(yīng)序號(hào)分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于AA2和B1，其它五種結(jié)果均可排除。（3）＋陽性、－陰性、＋/－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性。表323A 附1 尿素KCN賴氨酸判 定 結(jié) 果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）－＋＋沙門氏菌 Ⅳ 或 Ⅴ （要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個(gè)別變種（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）（2）反應(yīng)序號(hào)A2可先做血清學(xué)鑒定，當(dāng)A—F多價(jià)血清不凝集時(shí)，補(bǔ)作甘露醇和山梨醇，按表32—3附2判定結(jié)果。如果未做KCN試驗(yàn)時(shí)，常需做VP試驗(yàn)（22～250C，4天），哈夫尼亞菌屬為陽性。（2）抗原的鑒定用A—F多價(jià)O血清作玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水作對(duì)照。 不被A—F多價(jià)O血清凝集者，先用57種或144種沙門氏菌因子血清中的7種多價(jià)O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查。已知具有Vi抗原的菌型有傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌。2 基本原理志賀氏菌屬為埃希氏桿菌，包括痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌四群，是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌。3．2 設(shè)備和材料天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌平皿、酒精燈、載玻片、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架。檢 樣25g＋GN 225mlHE瓊脂或SS麥康覬或EMB挑取可疑菌落TSI，葡萄糖半固體36177。志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明的中等大小的光滑型菌落。（2）志賀氏菌屬分群生化試驗(yàn) 要將志賀氏菌屬分群，應(yīng)做5%乳糖、甘露醇、棉子糖和甘油的分解試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)。若呈現(xiàn)凝集，則用AA2群多價(jià)和D群血清分別試驗(yàn)。福氏志賀氏6型生化特性與A或C群相似。2 基本原理蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種食品中檢出。3．2 培養(yǎng)基和試劑甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基、肉浸液肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、動(dòng)力－硝酸鹽培養(yǎng)基、木糖－明膠培養(yǎng)基、緩沖葡萄糖蛋白胨水、血瓊脂培養(yǎng)基、3％過氧化氫溶液、70%酒精、革蘭氏染色液、甲醇、%堿性復(fù)紅染色液、甲萘胺－醋酸溶液、對(duì)氨基苯磺－醋酸溶液等。1℃ 20h12～檢樣做成101~105的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測(cè)定）菌數(shù)測(cè)定選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）肉湯培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)及菌落觀察染色鏡檢生化試驗(yàn)生化試驗(yàn)報(bào)告37℃，18～24h圖34－1 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)程序4．2 菌數(shù)測(cè)定以無菌操作將檢樣25g或25mL按菌落總數(shù)測(cè)定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成101～105的稀釋液。根據(jù)試驗(yàn)證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計(jì)算出該培養(yǎng)皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即