【正文】 瓊脂上的培養(yǎng)物，作玻片凝集試驗。（2）志賀氏菌屬分群生化試驗 要將志賀氏菌屬分群，應做5%乳糖、甘露醇、棉子糖和甘油的分解試驗，靛基質(zhì)試驗。志賀氏菌在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應結(jié)果為底層產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可微產(chǎn)氣)，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)生硫化氫，無動力，在半固體管內(nèi)沿穿剌線生長。志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明的中等大小的光滑型菌落。１℃，18－24hTSI底層產(chǎn)酸，斜面產(chǎn)堿， H2S－，不產(chǎn)氣，無動力非如左述的各種反應結(jié)果血清學分型生化分群試驗志賀氏菌屬分群及分型結(jié)果進一步的生化試驗葡萄糖銨試驗、西蒙氏檸檬酸鹽、賴氨酸、尿素、KCN、水楊苷和七葉苷葡萄糖銨＋或任何其他陽性結(jié)果非志賀氏菌非志賀氏菌報 告圖331 志賀氏菌檢驗程序4．3 分離 取一環(huán)增菌液，劃線接種于HE瓊脂平板或SS平板一個，麥康凱瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板一個，于36177。檢 樣25g＋GN 225mlHE瓊脂或SS麥康覬或EMB挑取可疑菌落TSI，葡萄糖半固體36177。4 實驗方法與步驟4．1 志賀氏菌檢驗程序（如圖331）4．2 增菌稱取檢樣25g加入裝有225mL GN增菌液的500mI廣口瓶內(nèi)（固體食品應用均質(zhì)器以8，000～10，000r/mi打碎1min，或用研缽研碎），于培養(yǎng)36177。3．2 設備和材料天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌平皿、酒精燈、載玻片、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架。志賀氏菌的鑒定主要根據(jù)血清學反應，再以生化反應證實。2 基本原理志賀氏菌屬為埃希氏桿菌，包括痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌四群，是引起人類細菌性痢疾的病原菌。6 思考題（1）如何提高沙門氏菌的檢出率？（2）沙門氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基上的反應結(jié)果如何？（3）沙門氏菌屬檢測主要包括哪幾個主要步驟？實驗6 食品中志賀氏菌屬的檢驗1 目的要求（1）了解志賀氏菌的形態(tài)、培養(yǎng)以及生化反應等特性。已知具有Vi抗原的菌型有傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌。單菌相不必作位相變異檢查。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查。不常見的菌型，先用144種沙門氏菌因子血清中的6種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查以確定第1相或第2相的H抗原。 不被A—F多價O血清凝集者，先用57種或144種沙門氏菌因子血清中的7種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。被A—F多價O血清凝集者，依次用OOOOOOO和O11因子血清作凝集試驗，根據(jù)試驗結(jié)果判定O群。（2）抗原的鑒定用A—F多價O血清作玻片凝集試驗，同時用生理鹽水作對照。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的(如2．5～3％)培養(yǎng)基上再檢查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時，可挑取菌苔于lmL生理鹽水中作成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。如果未做KCN試驗時，常需做VP試驗（22～250C，4天），哈夫尼亞菌屬為陽性。必要時按表32—4，進行沙門氏菌屬亞屬Ⅲ或其它亞屬的鑒定.表323 附3賴氨酸烏氨酸ONPG水楊苷棉子糖動力判定結(jié)果＋＋－－－＋沙門氏菌屬－－－－－－志賀氏菌屬－＋＋－－－宋內(nèi)氏志賀氏菌屬dd＋ddd埃希氏菌屬注：判定結(jié)果時應注意傷寒沙門氏菌鳥氨酸陰性，甲型副傷寒沙門氏菌賴氯酸陰性，雞沙門氏菌無動力。表323A 附1 尿素KCN賴氨酸判 定 結(jié) 果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結(jié)果）－＋＋沙門氏菌 Ⅳ 或 Ⅴ （要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個別變種（要求血清學鑒定結(jié)果）（2）反應序號A2可先做血清學鑒定，當A—F多價血清不凝集時，補作甘露醇和山梨醇，按表32—3附2判定結(jié)果。如尿素、KCN和賴氨酸三項中有一項異常、按表32—3附1仍可判定為沙門氏菌。（3）＋陽性、－陰性、＋/－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性。斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。按反應序號分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應屬于AA2和B1，其它五種結(jié)果均可排除。4．5生化試驗在接種三糖鐵的同時，再接種蛋白胨水(供作靛基質(zhì)試驗)、尿素（）瓊脂、KCN培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于36177。表322 腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣H2S可能的菌屬－＋＋/－＋沙門氏菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、愛德華氏菌屬＋＋＋/－＋沙門氏菌屬亞屬Ⅲ、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬－＋＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬該表說明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時H2S陰性的菌株可以排除，其它的反應結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。4．4三糖鐵高層瓊脂初步鑒別挑選上述選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種到三糖鐵瓊脂斜面試管中，于36177。SS瓊脂無色透明，產(chǎn)生H2S菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn)H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100mlBSDHL(或HE、WS、SS)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、產(chǎn)氣、H2S），蛋白胨水（靛基質(zhì)），尿素（），KCN，賴氨酸H2S+，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S+，靛基質(zhì)＋ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S－，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋/－非如左述的各種反應結(jié)果甘露醇、山梨醇沙門氏菌血清學試驗ONPG非沙門氏菌沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌報 告檢樣勻25ml＋SC100ml（或TTB）100ml圖321 沙門氏菌屬檢驗程序表321 沙門氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亞屬Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸 瓊脂產(chǎn)H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色、菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生H2S，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變色。1℃18～24h42℃42℃36177。１℃18～24h18～24h36177。一般4h，干蛋品18～24h36177。1℃分別培養(yǎng)18～24h(DHL、HE，SS)或40～48h(BS)。4．3 分離取增菌液一環(huán)，劃線接種于BS平板一個和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個。各取25mL加入滅菌生理鹽水225mL，按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)于42℃培養(yǎng)24h，另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36177。l℃培養(yǎng)18～24h。1℃培養(yǎng)4h(干蛋品需培養(yǎng)18～24h)，移取10mL轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24h。各稱取樣品25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內(nèi)，固體食品可用均質(zhì)器，8000～10000rpm/min打碎lmin，或用研缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。P試劑)，丙二酸鈉培養(yǎng)基，氧化酶試劑，革蘭氏染色液，26種(初步分型)、57種(一般分型)、144種(詳細分型)沙門氏菌因子血清。3 實驗材料3．1設備和材料 天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。根據(jù)沙門氏菌屬的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質(zhì)，尿素、KCN，賴氨酸等試驗可與腸道其它菌屬相鑒別。沙門氏菌屬細菌由于不發(fā)酵乳糖，能在各種選擇性培養(yǎng)基上生成特殊形態(tài)的菌落。為了分離與檢測食品中的沙門氏菌，對某些加工食品必須經(jīng)過前增菌處理，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于頻死狀態(tài)的沙門氏菌恢復其活力，再進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細菌受到抑制，然后再進行分離鑒定。2 基本原理沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。（2）熟悉沙門氏菌屬因子血清的使用方法。（2）實驗中操作者須注意生物安全防護，實驗結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實驗材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。乙類溶血性鏈球菌在血平板上對桿菌胎敏感，經(jīng)37℃培養(yǎng)18小時，出現(xiàn)明顯抑菌圈。乙型溶血性鏈球菌菌落周圍呈完全溶血，并有明顯的溶血境界。液體培養(yǎng)基中易呈長鏈，固體培養(yǎng)基中常呈短鏈。同時用已知陽性菌株作為對照。4．7 桿菌肽敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌液涂布于血平板上，置于36177。若24h后不溶解即為陰性。1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固 (凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動)。，再加入18～24h 36177。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，～，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2～4mm界限分明、無色透明的溶血圈。4．5 培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長較好。1℃培養(yǎng)24h，挑取乙型溶血圓形突起的細小菌落在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌肽敏感試驗。4．3 一般培養(yǎng)將上述混懸液吸取5mL，接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯或直接劃線接種于血平板，如檢樣污染嚴重，可同時按上述量接種匹克氏肉湯，經(jīng)36177。１℃24h血干板（分純培養(yǎng)）36177。4 實驗方法與步驟：4．1溶血性鏈球菌檢驗程序（如圖311）36177。3 實驗材料3．1設備和材料 溫箱、水浴、顯微鏡、離心機、試管架、滅菌平皿、滅菌小試管、載玻片、滅菌吸管（1mL、10mL）滅菌鑷子、均質(zhì)器、酒精燈、接種環(huán)。2 基本原理乙型（β）溶血性鏈球菌致病性強，能產(chǎn)生溶血毒素，在血平板上生長，可使菌落周圍形成一個有2～4mm寬，界限分明，完全透明的無色溶血環(huán)，稱乙型溶血；還能產(chǎn)生鏈激酶（又稱溶纖維蛋白酶），激活血漿中的血漿蛋白酶原，使之變成活動性的血漿蛋白酶，故可溶解血塊或阻止血漿凝固；還可以產(chǎn)生胞外cAMP因子，它可以增強葡萄球菌的溶血能力，即增強對羊、牛血紅細胞的溶解能力。（2）觀察溶血性鏈球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板上菌落特征及溶血情況。（2）實驗中操作者須注意生物安全防護，實驗結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實驗材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。（3）致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽性。在中毒食品、膿汁或液體培養(yǎng)基中常呈單個或環(huán)球短鏈排列，易誤認為鏈球菌或細球菌。5 實驗結(jié)果（1）金黃色葡萄球菌涂片染色鏡檢為陽性球菌，致病性葡萄球菌一般較非致病性葡萄球菌小，且各個菌體的大小排列也較整齊。1℃24h培養(yǎng)后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)法。1℃溫箱培養(yǎng)。如水分不多吸收，可將平板放在36177。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。（5）血漿凝固酶試驗吸取1∶，放入小試管中，振蕩搖勻，放36177。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明圈。（4）培養(yǎng)特征在肉湯中呈混濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，也有時為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。1℃培養(yǎng)24h，挑取可疑金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。（2）增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36177。3．2 培養(yǎng)基及試劑 胰酪胨大豆肉湯、%氯化鈉肉湯、豆粉瓊脂、血瓊脂平板、BairdParker瓊脂平板、肉浸液肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液等。此酶類似凝血酶原物質(zhì)，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變成固態(tài)纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態(tài)。在BairdParker氏平板上生長時，因?qū)嗧谒徕涍€原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產(chǎn)生脂酶使菌落周圍有一渾濁帶，而在其外層因產(chǎn)生蛋白水解酶有一透明帶。2 基本原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。（2）觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板和BairdParker氏瓊脂平板上生長的菌落特征。7 思考題（1）什么是大腸菌群？大腸菌群表示的單位及其意義。如由軍事醫(yī)學科學研究院研制而成的一小時快速檢測法，檢驗結(jié)果與國標法一致。所以大腸菌群的測定是必做的食品衛(wèi)生學檢項目。本菌在糞便中數(shù)量多，易于培養(yǎng)，對外界的抵抗力與腸道致病菌比較相近，所以選擇大腸埃希氏菌作為被糞便污染的指示菌，合理、科學。如果樣品檢測以非典型大腸菌為主，則指示樣品受糞便的遠期污染。研究表明，典型大腸菌隨糞便排到外界環(huán)境中約一周后，典型菌可變?yōu)榉堑湫途?。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類型。應做進一步觀察，因為這種情況陽性檢出率可達50%以上。如果平板上典型菌落少，應多挑取菌落包