【正文】 塞。6．加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，～1．稱藥品 　按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。7H2O，F(xiàn)eSO4利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 含有一般細(xì)菌生長繁殖需要的基本的營養(yǎng)物質(zhì)。(3)半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計數(shù)和菌種保存等方面。這類培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯，前者用于培養(yǎng)霉菌，后者用于培養(yǎng)細(xì)菌。合成培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。由于各種微生物所需要的營養(yǎng)不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。(5)鏡檢 根據(jù)需要可以在不同的培養(yǎng)時間內(nèi)取出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡。~1cm2的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上。(1)培養(yǎng)小室的滅菌 在平皿皿底鋪一張略少于皿底的圓濾紙片，再放一U型玻璃棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋。 (3) 將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞。(2) 用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢地將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。 %%呂氏堿性美藍(lán)染色液，革蘭氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。培養(yǎng)一定時間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置顯微鏡下觀察。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，可用低倍顯微鏡觀察。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。 2．學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌的基本方法，了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。2．你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？3．現(xiàn)有一株細(xì)菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應(yīng)。 6．鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。 3．媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。 3. 儀器或其它用具 顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實驗原理： 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此基礎(chǔ)上作了某些改進(jìn)。三. 教學(xué)學(xué)時分配與安排本課程按每周3學(xué)時安排， 共6個實驗，總學(xué)時18。根據(jù)本學(xué)科的特點，逐步使學(xué)生認(rèn)識微生物的基本特性，比較它們與其它生物的相似和不同之處，知道如何研究微生物以及對研究中所出現(xiàn)的問題點樣分析，并加以解決。此外，醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、林學(xué)等學(xué)科，甚至地質(zhì)學(xué)、太空學(xué)等也需微生物的方法與技術(shù)。因此，熟悉掌握微生物學(xué)方法與技術(shù)，對其它很多學(xué)科的發(fā)展有直接的影響。二、教學(xué)要求與教學(xué)方法1. 教學(xué)要求1)目錄實驗一 細(xì)菌的革蘭氏染色………………………………………3 實驗二 根霉、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察…………………………4實驗三 培養(yǎng)基制備………………………………………………6實驗四 滅菌與消毒………………………………………………9實驗五 微生物的分離和純化……………………………………12實驗六 微生物的生理生化反應(yīng)…………………………………14實驗七 水中細(xì)菌總數(shù)的測定……………………………………19實驗八革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，象簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。實驗內(nèi)容：1．制片 取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。 4．脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。菌體被染成藍(lán)紫色是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進(jìn)行涂片染色，以證明你的染色結(jié)果正確性。實驗原理：酵母菌是不運動的單細(xì)胞真核微生物，其大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的、而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。觀察霉菌的形態(tài)主要有三種方法，直接制片觀察法：是將培養(yǎng)物放置于乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液中，制成霉菌制片鏡檢，其制片的特點是：細(xì)胞不變形；具有防腐作用，不易干燥，能保存較長時間；能防止孢子飛散；染液的藍(lán)色能增強(qiáng)反差。這中方法既可以保持霉菌自然生長狀態(tài)，還便于觀察不同發(fā)育時期的培養(yǎng)物。 玻璃紙培養(yǎng)觀察法：霉菌的玻璃紙培養(yǎng)觀察方法與放線菌玻璃紙培養(yǎng)觀察方法相似。 顯微鏡， 載玻片 ，蓋玻片，無菌吸管 ，平皿 ，載玻片， 蓋玻片， U型玻璃棒 ，解剖針 ，鑷子 ，50%乙醇 ，20%的甘油等。(4) ，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。包扎后121176。(3)接種 用尖細(xì)的接種針挑取很少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋再瓊脂塊上。實驗報告：1．繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征2．說明觀察到的呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時間不同，對酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？分析其原因。可以根據(jù)微生物種類和實驗?zāi)康牟煌殖扇舾深愋?。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，但價格較貴，而且微生物在這類培養(yǎng)基中生長較慢。這類培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不恒定，也難以確定，但配制方便，營養(yǎng)豐富，所以常被采用。培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三類。(2)液體培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。⑷鑒別培養(yǎng)基 是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使微生物培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。7H2O。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。3． 調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達(dá)到所需pH范圍。4．過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。7．包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl ，K2HPO4l．稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。7H2O，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于20℃)，在100mL培養(yǎng)基中加1% ，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg。實驗報告：l．配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查?3． 細(xì)菌能在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長嗎？為了分離放線菌，你認(rèn)為應(yīng)該采取什么措施？4． 什么是選擇性培養(yǎng)基？它在微生物學(xué)工作中有何重要性？5． 如果在用馬丁氏培養(yǎng)基分離真菌時，發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，你認(rèn)為是什么原因？你將如何進(jìn)一步分離純化得到所需要的真菌？實驗四 滅菌與消毒實驗?zāi)康模?．了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。3．了解紫外線滅菌的原理和方法。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表1），二是濕熱的穿透力比干熱大（表2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見（表3）表3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/℃2/3空氣排出時的溫度/℃1/2空氣排出時的溫度/℃1/3空氣排出時的溫度/℃空氣全不排出時的溫度/℃MpaKg/cm2Ib/in2510094907210109105100901．0515115112109100201211181151092512612412111530130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=；1Ib/in2=.（相當(dāng)于15 Ib/），℃，15～30min可達(dá)到徹底滅菌的目的。實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式和手提式二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。紫外線殺菌機(jī)理主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。3．儀器或其他用具 培養(yǎng)皿，試管，吸管，電烘箱，培養(yǎng)皿(6套一包)， 手提式高壓蒸氣滅菌鍋，紫外線燈等。當(dāng)溫度升至100℃時，關(guān)閉排氣孔。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。二 高壓蒸氣滅菌1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。共做三套。（2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%～3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。實驗原理：從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定。4．儀器或者其他用具 無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計數(shù)板等。(3) 涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上104，105，106三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由104，105，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基；2．平板劃線分離法(1)倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，土樣編號和實驗日期；(2) 劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述101的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。實驗報告：1．5．為什么高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？實驗六 微生物的生理生化反應(yīng)