【正文】 平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。厭氧培養(yǎng)常用的方法有：物理法、化學法、生物法。于35℃孵育箱內孵育。（3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養(yǎng)皿放入袋內，盡量祛除袋內空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。（1）二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動調節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養(yǎng)物置于孵育箱內閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結果。1．需氧培養(yǎng)是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)，將已接種好的平板、斜面、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h，無特殊要求的細菌均可生長。每ml標本中的細菌數(shù)=全平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù)6．涂布接種法本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)лr2此接種法應避免接種環(huán)與液體過多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實驗室污染。接種時用接種針挑取菌落，再沿穿刺線退出接種針。瓊脂斜面接種法主要用于菌落的移種，以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。微生物培養(yǎng)與分離方法大多數(shù)細菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。用第二液脫色2min，水洗。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果②在玻片上滴蒸餾水1滴。3．特殊染色法（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理③用第3液脫色1~2min，水洗。③加呂氏美藍復染液數(shù)滴復染1min，水洗。(ZiehlNeelse)抗酸染色法：①細菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。（二）常用染色法（染液配方見第8章）單染色法只用一種染料染色。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。（一）細菌染色的一般程序細菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脫色）—（復染）。通常選用60~70mm長。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。二、不染色標本檢查不染色標本一般可用于觀察細菌形態(tài)、動力及運動情況。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。3．相差顯微鏡相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉換為光強度差。000倍。常用顯微鏡有如下幾種。醫(yī)學微生物學實驗室的基本任務之一是利用微生物學檢驗技術，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進行耐藥性監(jiān)測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學調查及研究等提供科學依據(jù)。第一節(jié)　微生物形態(tài)學檢查細菌形態(tài)學檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類和鑒定的基礎，可根據(jù)其形態(tài)、結構和染色反應性等，為進一步鑒定提供參考依據(jù)。1．普通光學顯微鏡　　采用自然光或燈光為光源。普通光學顯微鏡可用于細菌、放線菌和真菌等的觀察。在相差顯微鏡下，當光線透過不染色標本時，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態(tài)、內部結構和運動方式等。用藍光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進行觀察。1．懸滴法在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。~，用火焰將毛細管兩端熔封。1．涂片制備血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。3．染色根據(jù)檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。6．復染已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。由于大多數(shù)細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。（1）革蘭染色：①細菌涂片經(jīng)火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數(shù)滴進行復染，約30s，水洗。染液因蒸發(fā)減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。②滴加乙液，染1min。菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進行研究、鑒定和應用。平板劃線分離法通常有兩種方法：（1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分離。一個成功分區(qū)劃線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌落。用接種環(huán)（針）挑取單個菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。5．傾注平板法本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數(shù)。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細菌形成菌苔。少數(shù)生長緩慢的細菌需要培養(yǎng)37d甚至1個月才能生長。2．二氧化碳培養(yǎng)某些細菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養(yǎng)，特別是在初次分離時，須在5%~10（2）燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養(yǎng)基放入缸內，點燃蠟燭后放在缸內稍高于培養(yǎng)物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。使袋呈密閉狀態(tài)，執(zhí)斷袋內已置的二氧化碳產(chǎn)氣管（安瓿）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境，置于35℃孵育箱內孵育。3．微需氧培養(yǎng)微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及絕對無氧環(huán)境中均不能生長，在含有5%6%如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。據(jù)細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。2．液體培養(yǎng)基細菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。細菌的生物化學試驗各種細菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。所使用的糖（醇、苷）類有很多種，根據(jù)不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見表641。不分解糖則無變化。常用于細菌糖發(fā)酵試驗的糖、醇類單糖四碳糖：赤蘚糖乳糖（葡萄糖＋半乳糖）淀粉醇類側金盞花醇甘露醇本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；兩管都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。(2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結果。4．β－半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）(1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。(3)結果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。400g/L本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。(3)結果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。(2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35℃孵育18~24h，加入革蘭碘液數(shù)滴，立即觀察結果。(2)方法：取被檢菌接種于甘油復紅肉湯培養(yǎng)基中，于35℃孵育，觀察2~8d。傷寒沙門菌、甲（丙）型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性，乙型副傷寒沙門菌結果不定，其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性。(3)結果：出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽性。(2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)。(4)應用：主要用于鑒別腸桿菌科細菌，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。(3)結果：如無凝固，則表示明膠已被水解，液化試驗陽性。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化。(4)應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。(2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化鐵試劑4~5滴，立即觀察菌落生長處有無綠色出現(xiàn)。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。6．精氨酸雙水解酶試驗(1)原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后,生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。結果：溴甲酚紫指示劑呈紫色為陽性，酚紅指示劑呈紅色為陽性。(2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，觀察結果。(2)方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入濃硫酸數(shù)滴，觀察結果。三、碳源和氮源利用試驗1．枸櫞酸鹽利用試驗(1)原理：某些細菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽性。(3)結果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色為陽性。(2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育2~7d，逐日觀察結果。(2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，置35℃孵育48h，離心沉淀，立即混勻，經(jīng)10~15min觀察結果。(2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h，觀察結果。銅綠假單胞菌、去硝化產(chǎn)堿桿菌、食酸假單胞菌為陽性，其它非發(fā)酵菌大多數(shù)為陰性。(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑（10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液）1滴，1min內觀察結果?！　?4)應用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細菌均陽性。①試驗時應避免接觸含鐵物質，以免出現(xiàn)假陽性。1滴，立即觀察結果。此外，金氏桿菌屬的細菌也為陰性。3．凝固酶試驗(2)方法:②試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。②血漿必須新鮮。(1)原理：(4)應用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。另一方面可能與激活細菌體內的自溶酶有關。35℃孵育每小時觀察1次結果。(4)應用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，則稱為脫硝化或脫氮化作用。(3)結果：出現(xiàn)紅色為陽性反應。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細菌能產(chǎn)生氮氣，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的則能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。(4)8．磷酸酶試驗(1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反應可根據(jù)反應基質不同而異，如用磷酸酚酞為基質，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。(4)應用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。(3)結果：培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{色者為陽性，否則可呈無色或粉紅色。因此，可在兩種細菌的交界處溶血力增強，出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)。(3)結果：兩種細菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽性。觀察結果。④胨化：將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解為胨，培養(yǎng)基上層液體變清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。(1)原理：Optochin(奧普托欣)是鹽酸乙基氫化羥基奎寧的商品名。(3)結果：抑菌圈直徑大于14mm為敏感，小于或等于故此試驗可對鏈球菌進行鑒別。結果：抑菌圈直徑大于10mm為敏感，小于10mm為耐藥。3．新生霉素敏感試驗(3)結果：抑菌圈直徑大于16mm為敏感，小于或等于16mm為耐藥。(3)結果：出現(xiàn)抑菌圈者表示敏感，無抑菌圈者為耐藥。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀與鐵卟啉結合，使這些酶失去活性，使細菌生長受到抑制。六、其它試驗1．克氏雙糖鐵或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗(1)原理：克氏雙糖鐵(KIA)或三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基制成高層和短的斜面，其中葡萄糖