【正文】 4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。標(biāo)本觀察完畢后，先將物鏡頭移開，再轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈。用左眼觀察接目鏡，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使載物臺下降，待看到模糊的圖像時，再調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至看到清晰的圖像為止。將低倍鏡轉(zhuǎn)到中央并對準(zhǔn)下面的聚光器，打開光圈，轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光源時，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時用平面反光鏡）。（3）油鏡：鏡頭標(biāo)志為100或 100/，鏡頭最長，其上常刻有白色環(huán)圈，或“oil”字樣。2．特殊結(jié)構(gòu)的觀察（莢膜、芽胞、鞭毛）觀察要點：注意這些特殊結(jié)構(gòu)的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細(xì)菌的鑒定。3．掌握光學(xué)顯微鏡油鏡的使用和維護方法，了解熒光顯微鏡和暗視野顯微鏡的構(gòu)造和使用方法。5．生物廢棄材料的管理實驗室內(nèi)所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴(yán)禁未經(jīng)處理就隨意丟棄，應(yīng)置于貼有生物危害標(biāo)志的專用廢棄物處理容器內(nèi)，注意容器的充滿量不能超過其設(shè)計容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應(yīng)置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終處置前應(yīng)存放在指定的安全地方，經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運出實驗室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放；動物尸體、組織的處置和焚化應(yīng)符合國家相關(guān)要求。4．實驗室常見生物危險實驗室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標(biāo)本中的污染源在空氣中傳播、微生物氣溶膠的吸入）、直接傳播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚粘膜接觸（臨床標(biāo)本中的傳染源通過破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的實驗室相關(guān)感染。（10）在實驗室出口處設(shè)有在黑暗中可明確辨認(rèn)方向、通道的標(biāo)識。（7）在實驗室內(nèi)應(yīng)穿戴隔離衣、帽、手套，必要時戴防護眼鏡。（3）實驗室工作區(qū)域外有足夠的存儲空間及擺放個人衣物的設(shè)施。BSL4實驗室必須與其他實驗室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng)，實驗操作須在Ⅲ級生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護服。根據(jù)WHO《實驗室生物安全手冊》和我國衛(wèi)生部2002年頒布的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》，實驗室從生物安全防護的角度共分為四級：一級生物安全防護實驗室（BSL1）為實驗室結(jié)構(gòu)設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于危險度1級的微生物，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序可進行開放性操作，如用于教學(xué)的普通微生物實驗室即屬此類。因此實驗室工作人員在實驗過程中必須高度重視實驗室生物安全防護，強化生物安全意識，熟悉生物安全防護有關(guān)知識，嚴(yán)格無菌操作。（3）燒傷：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（7）實驗完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹布將操作臺擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門窗。（5）實驗中注意節(jié)約試劑，愛護儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應(yīng)立即報告老師及時作適當(dāng)處理。（2）進入實驗室必須穿工作服，必要時還須戴口罩、帽子和手套，并做好實驗前的各項準(zhǔn)備工作。4．在實驗過程中逐漸培養(yǎng)獨立思考問題、分析問題和解決問題的能力。微生物學(xué)檢驗實驗指導(dǎo) 2009．7一、《微生物學(xué)檢驗》實驗?zāi)康囊?．通過實驗驗證理論知識，并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)。二、微生物學(xué)實驗室規(guī)則及實驗室意外處理方法1．微生物學(xué)實驗室規(guī)則由于微生物學(xué)實驗是以病原微生物為研究對象，在實驗過程中任何疏忽大意都有可能引起實驗人員的自身感染或?qū)嶒炇液椭車h(huán)境的污染。（3）非必需物品禁止帶入實驗室，帶入實驗室的物品應(yīng)遠(yuǎn)離操作區(qū)，放在指定的區(qū)域。（6）用過的污染物品應(yīng)放到指定的地點，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實驗室。（4）菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高錳酸鉀或3%過氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當(dāng)抗生素預(yù)防感染。1．微生物的分類等級根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）出版的《實驗室生物安全手冊》，將微生物分為四個不同危險度等級：危險度1級是指不能引起人或動物致病的微生物，此類微生物無或僅具有極低的個體和群體危險；危險度2級的病原體具有中度個體危險，低度群體危險，能引起人或動物致病，但對實驗室工作人員、社區(qū)、家畜或環(huán)境不易導(dǎo)致嚴(yán)重危害，所引起的感染具有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險有限；危險度3級的病原體具有高度個體危險，低度群體危險，通常能引起人或動物的嚴(yán)重疾病，但一般不會發(fā)生感染的播散，并且對感染具有有效的預(yù)防和治療措施；危險度4級的病原體具有高度的個體危險和群體危險，通常能引起人或生物的嚴(yán)重疾病，并且很容易發(fā)生個體之間的直接或間接傳播，對感染一般沒有有效的預(yù)防和治療措施。二級生物安全防護實驗室（BSL2）適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物，即危險度2級的病原體，該級別實驗室應(yīng)具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實驗室因接觸可能含有致病微生物的標(biāo)本，通常應(yīng)達到二級生物安全防護實驗室要求。（4）實驗室內(nèi)墻壁、地面應(yīng)平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。實驗室應(yīng)備有生物安全柜。（11）在實驗室入口處和裝有傳染性物質(zhì)的設(shè)備表面貼有生物危險標(biāo)志。實驗室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤﹑不良實驗技術(shù)以及儀器使用不當(dāng)造成的。處理危險廢棄物的人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，并使用適當(dāng)?shù)姆雷o設(shè)備?！驹噭┡c器材】1．示教片：各種球菌、桿菌、弧菌、莢膜、鞭毛、芽胞的示教片。二、光學(xué)顯微鏡油鏡的使用1．光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造光學(xué)顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)最常用的一種儀器，其構(gòu)造分為機械部分和光學(xué)部分，機械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、鏡頭轉(zhuǎn)換器、調(diào)焦裝置等；光學(xué)部分包括：接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖11）。 2．油鏡的使用原理圖12 顯微鏡油鏡的使用原理油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標(biāo)本片透過的光線，因玻片和空氣的折光率不同（玻璃n=，空氣n=），部分光線經(jīng)載玻片進入空氣后發(fā)生折射，不能進入接物鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。根據(jù)所觀察的標(biāo)本，通過升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。（3）油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調(diào)至清晰之后，轉(zhuǎn)開物鏡頭，在玻片的標(biāo)本上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉(zhuǎn)換至中央，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭浸入油中，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉(zhuǎn)動（從側(cè)面觀察），邊觀察接目鏡邊輕輕轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（此時只能上升鏡頭，不能下降，防止壓壞玻片及損壞物鏡），待看到模糊物象時改調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至找到清晰物象。4．注意事項（1）顯微鏡是精密光學(xué)儀器，在搬放時應(yīng)右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。更換接物鏡時，卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺面上，并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內(nèi)。（7）顯微鏡擦凈后，取下標(biāo)本片，下降聚光器，再將物鏡轉(zhuǎn)成“品”字形，送至顯微鏡室放入鏡箱內(nèi)。故在強光照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)亮的菌體。（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺上的載玻片底面接觸，（4）其余操作同光學(xué)顯微鏡。（2）裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。【結(jié)果記錄和報告】實驗二 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查【目的和要求】1．熟悉細(xì)菌染色的常用染料和一般程序?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。單染法是用一種染料去染，所有細(xì)菌都染成一種顏色；復(fù)染法是用多種染料對細(xì)菌進行染色，不同細(xì)菌可染成不同的顏色。（3）通透性學(xué)說：革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫色時，乙醇不易進入，而且95％乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠(yuǎn)處微微加熱烘干，但切勿靠近火焰。4．注意事項：（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過字跡為宜（半透明）。（4）所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上積水過多會降低染液濃度，影響染色效果。1．細(xì)胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。2．鞭毛染色法（改良Ryu法）鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意動作盡量輕，以免鞭毛脫落。（2）在玻片上加蒸餾水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細(xì)菌點在蒸餾水滴的頂部（一般只需點一下，僅允許極少量細(xì)菌進入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動，以免鞭毛脫落。觀察時應(yīng)從細(xì)菌較少的地方尋找鞭毛。1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過程中應(yīng)隨時添加染液，冷卻后水洗。4．莢膜染色法（1）黑斯氏法1）涂片，自然干燥，加熱固定。（2）密爾氏法1）涂片：，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加熱固定。結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍色。因此，不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的動力，常用的方法有以下幾種。2．懸滴法取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林。無鞭毛細(xì)菌不能做真正的運動，但受水分子的撞擊而呈分子運動（布朗運動），即在一定范圍內(nèi)作來回顫動，位置移動不大，注意與細(xì)菌的鞭毛運動相鑒別。【試劑與器材】 1．試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時，再用自來水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內(nèi)數(shù)小時，將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來水反復(fù)沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用。4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3~5％的來蘇液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時，最后用自來水洗凈，晾干備用。2．常用無菌器材的準(zhǔn)備（1）包裝1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內(nèi)。4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。在使用前不能隨意打開，一經(jīng)打開則不再認(rèn)為是無菌的。其他培養(yǎng)基大多是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營養(yǎng)物質(zhì)、抑菌劑、檢測基質(zhì)、指示劑等）配制而成。（3）矯正PH：用PH比色計、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH，~。將4支試管按圖31所示插入比色架中進行比色。（4）過濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過濾。滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在傾注平板前應(yīng)冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝于無菌平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿分裝量約13~15ml），待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉(zhuǎn)，即為瓊脂平板。（6）滅菌 根據(jù)培養(yǎng)基的成分、性質(zhì)采用不同的滅菌方法。 4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過夜。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過久。（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個雞蛋的卵蛋白加水20ml，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸汽加熱30~60min，使培養(yǎng)基中的不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或濾紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。2．掌握細(xì)菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機、記號筆等。一般要求接種環(huán)長5~8cm，直徑為2~4mm。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開，試管口通過火焰燒灼滅菌。圖42 液體培養(yǎng)基接種法2．半固體培養(yǎng)基的接種該法可用于保存菌種、觀察細(xì)菌的動力或進行細(xì)菌的生化反應(yīng)。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線接種法該法可將標(biāo)本中的多種細(xì)菌分散成單個菌落，有利于細(xì)菌的分純和進一步鑒定。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細(xì)菌污染。2）同上法將平板蓋打開約30~45176。圖45 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的純培養(yǎng)，以進一步鑒定細(xì)菌或保存菌種。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉(zhuǎn)動平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。半固體培養(yǎng)基接種時注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。三、細(xì)菌的培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法 該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。（2）燭缸法：取一有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。2）氣體發(fā)生袋法（Gaspak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉氯化鈷合劑、碳酸氫鈉檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生H2和CO2。使用時將接種細(xì)菌的平板放入袋