微生物學實驗[最終定稿]-wenkub
2024-10-29 04 本頁面
【正文】 種可行的檢測方法。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。調節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線，或只見豎線或只見橫線。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。B（個）同理，如果是16個中方格的計數板，1mL菌液中的總菌數=A/516104B=32000A計數室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。顯微鏡直接計數法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。（二）基本原理顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點，工作中應根據具體情況要求加以選擇。第一篇：微生物學實驗細菌群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法和光電比濁計數法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、PeteroffHauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。B（個）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。3．加樣品將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。在計數前若發(fā)現菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。二平板菌落計數法（一）目的要求學習習近平板菌落計數的基本原理和方法。因此平板菌落計數的結果往往偏低。2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。依次標是1010101010106。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。圖15—3平板菌落計數操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。五、實驗報告1．結果2．將培養(yǎng)后菌落計數結果填入下表稀釋度104105106Cfu數/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優(yōu)缺點及應用。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖154)。本實驗采用血細胞計數板計數。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升110210410610810101012106含菌數的細胞懸液。2．樣品測定將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。（五）實驗報告l．結果每毫升樣品原液菌數=從標準曲線查得每毫升的菌數稀釋倍數2．思考題(1)光電比濁計數的原理是什么?這種計數法有何優(yōu)缺點?(2)光電比濁計數在生產實踐中有何應用價值?(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?四 大腸桿菌生長曲線的測定(一)目的要求1．通過細菌數量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養(yǎng)時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。圖15—5 帶側臂試管的三角燒瓶(三)器材1．菌種 大腸桿菌2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。3．培養(yǎng)將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1116和20h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。(五)實驗報告1．結果(1)將測定的OD600值填入下表：培養(yǎng)時間對照 0 3 4 6 8 10 12 14 16 20光密度值OD600(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。
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