【正文】 微生物學檢驗實驗指導 2009．7一、《微生物學檢驗》實驗目的要求1．通過實驗驗證理論知識，并掌握比較全面的微生物學基本操作技術。2．在微生物學實驗過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術。3．通過實驗進一步掌握臨床常見病原微生物的生物學性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方法、各種臨床標本的微生物學檢驗程序和方法。4．在實驗過程中逐漸培養(yǎng)獨立思考問題、分析問題和解決問題的能力。二、微生物學實驗室規(guī)則及實驗室意外處理方法1．微生物學實驗室規(guī)則由于微生物學實驗是以病原微生物為研究對象，在實驗過程中任何疏忽大意都有可能引起實驗人員的自身感染或實驗室和周圍環(huán)境的污染。因此，實驗中應嚴格遵守實驗規(guī)則，建立無菌觀念，嚴格無菌操作，防止實驗過程中出現(xiàn)意外情況，并確保實驗結果的準確。（1）試驗前須預習實驗內容，了解實驗目的、方法和注意事項，做到心中有數(shù)，避免發(fā)生錯誤，提高實驗效率。（2）進入實驗室必須穿工作服，必要時還須戴口罩、帽子和手套，并做好實驗前的各項準備工作。（3）非必需物品禁止帶入實驗室，帶入實驗室的物品應遠離操作區(qū)，放在指定的區(qū)域。（4）實驗室內不準大聲喧嘩、嬉戲，應保持實驗室的安靜、整潔和有序。不準在實驗室內吸煙、飲水和進食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內活動，以免引起風動。（5）實驗中注意節(jié)約試劑，愛護儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應立即報告老師及時作適當處理。（6）用過的污染物品應放到指定的地點，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。禁止將本實驗室的物品帶出實驗室外。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應標記清楚后送到指定地點。（7）實驗完畢后應將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹布將操作臺擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關好水、電、門窗。（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實驗室。2．實驗室意外的緊急處理方法（1）發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進行消毒，立即進行醫(yī)療處理。（2）化學藥品腐蝕傷：若為強酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和；若為強堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經(jīng)上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。（3）燒傷：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（4）菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高錳酸鉀或3%過氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當抗生素預防感染。（5）菌液污染環(huán)境：將適量2~3%%新潔爾滅浸泡污染面半小時后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗凈。三、生物安全防護知識簡介醫(yī)學檢驗工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標本，這些標本往往是各種細菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實驗人員感染，還是造成實驗室和周圍環(huán)境的污染，都將導致嚴重的后果。因此實驗室工作人員在實驗過程中必須高度重視實驗室生物安全防護，強化生物安全意識，熟悉生物安全防護有關知識，嚴格無菌操作。1．微生物的分類等級根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）出版的《實驗室生物安全手冊》，將微生物分為四個不同危險度等級：危險度1級是指不能引起人或動物致病的微生物，此類微生物無或僅具有極低的個體和群體危險；危險度2級的病原體具有中度個體危險，低度群體危險，能引起人或動物致病，但對實驗室工作人員、社區(qū)、家畜或環(huán)境不易導致嚴重危害，所引起的感染具有有效的預防和治療措施，并且疾病傳播的危險有限；危險度3級的病原體具有高度個體危險，低度群體危險，通常能引起人或動物的嚴重疾病，但一般不會發(fā)生感染的播散，并且對感染具有有效的預防和治療措施；危險度4級的病原體具有高度的個體危險和群體危險，通常能引起人或生物的嚴重疾病，并且很容易發(fā)生個體之間的直接或間接傳播，對感染一般沒有有效的預防和治療措施?；谝陨蟿澐謽藴?，結合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預防和治療措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關實驗活動需要達到的生物安全實驗室級別做了詳細分類，各實驗室進行有關實驗均需參照此標準。2．生物安全實驗室分級與要求由于各種病原微生物的危險度等級不同，因此實驗室必須達到相應的生物防護等級才能開展有關實驗。根據(jù)WHO《實驗室生物安全手冊》和我國衛(wèi)生部2002年頒布的《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》，實驗室從生物安全防護的角度共分為四級：一級生物安全防護實驗室（BSL1）為實驗室結構設施、安全操作規(guī)程、安全設備適用于危險度1級的微生物，依據(jù)標準操作程序可進行開放性操作，如用于教學的普通微生物實驗室即屬此類。二級生物安全防護實驗室（BSL2）適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物，即危險度2級的病原體，該級別實驗室應具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。三級生物安全防護實驗室（BSL3）適用于有明顯危害、可以通過空氣傳播的病原微生物（如結核桿菌、伯氏立克次體等），通常已有預防傳染的疫苗，該級別實驗室除了有嚴格的一級和二級安全設施要求外，還需具備合適的空氣凈化系統(tǒng)。四級生物安全防護實驗室（BSL4）適用于對人體具有高度的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。BSL4實驗室必須與其他實驗室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng)，實驗操作須在Ⅲ級生物安全柜內或全身穿戴特制的正壓防護服。根據(jù)以上定義，醫(yī)院內的臨床實驗室因接觸可能含有致病微生物的標本，通常應達到二級生物安全防護實驗室要求。根據(jù)《實驗室生物安全認可準則》，二級生物安全實驗室結構設施需符合以下幾點：（1）實驗室需具有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設計，有可開啟的窗戶，有紗窗，實驗室門有可視窗帶鎖并能自動關閉。（2）每個實驗室均應設置洗手池，宜設置在靠近出口處。（3）實驗室工作區(qū)域外有足夠的存儲空間及擺放個人衣物的設施。（4）實驗室內墻壁、地面應平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。（5）實驗臺面應能防水、耐腐蝕、耐熱。（6）實驗室內應保證工作照明，避免反光和強光。（7）在實驗室內應穿戴隔離衣、帽、手套，必要時戴防護眼鏡。實驗室應備有生物安全柜。（8）有適當?shù)南驹O施，如高壓蒸汽滅菌器，并設置洗眼裝置、應急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等。（9）有可靠的電力供應和應急照明。（10）在實驗室出口處設有在黑暗中可明確辨認方向、通道的標識。（11）在實驗室入口處和裝有傳染性物質的設備表面貼有生物危險標志。3．實驗室生物安全管理制度實驗室生物安全制度建設對于臨床實驗室而言是生物安全防護的核心，實驗室生物安全管理制度應包括：實驗室準入制度、生物安全培訓制度、生物安全責任制和責任追究制度、生物防護與安全制度、安全檢查制度、個人防護制度、實驗室管理制度、清潔消毒制度、安全計劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報告制度、生物安全防護應急預案、標準操作程序等。建立健全了各項生物安全制度，還應成立生物安全管理領導小組，加強生物安全制度實施情況的監(jiān)督管理，實驗室入口處須粘貼生物安全標志，注明危險因素，生物安全級別，負責人姓名和電話，進入實驗室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進入實驗室，如需參觀實驗室等特殊行為需經(jīng)實驗室負責人的批準后方可進入。4．實驗室常見生物危險實驗室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標本中的污染源在空氣中傳播、微生物氣溶膠的吸入）、直接傳播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚粘膜接觸（臨床標本中的傳染源通過破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的實驗室相關感染。實驗室傷害以及與工作有關的感染主要是由于人為失誤﹑不良實驗技術以及儀器使用不當造成的。因此，實驗室人員必須提高生物安全意識，認真學習生物安全相關的各種法規(guī)和文件，定期進行生物安全防護知識培訓，熟悉生物防護有關知識，加強基本技能的培養(yǎng)，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程。實驗室管理者應對實驗室的風險級別進行分析，尤其對風險級別較高的、接觸高危標本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學室予以高度重視，保護實驗室工作人員和環(huán)境的安全。5．生物廢棄材料的管理實驗室內所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴禁未經(jīng)處理就隨意丟棄，應置于貼有生物危害標志的專用廢棄物處理容器內，注意容器的充滿量不能超過其設計容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應置于耐扎銳器盒內，在去污染或最終處置前應存放在指定的安全地方，經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運出實驗室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放；動物尸體、組織的處置和焚化應符合國家相關要求。處理危險廢棄物的人員需經(jīng)過專業(yè)培訓，并使用適當?shù)姆雷o設備。第一章 微生物學檢驗基本技術實驗一 細菌的形態(tài)結構觀察及顯微鏡油鏡的使用【目的和要求】1．熟悉微生物實驗室規(guī)則并自覺遵守。2．掌握細菌基本形態(tài)和特殊結構的觀察方法。3．掌握光學顯微鏡油鏡的使用和維護方法，了解熒光顯微鏡和暗視野顯微鏡的構造和使用方法?！驹噭┡c器材】1．示教片：各種球菌、桿菌、弧菌、莢膜、鞭毛、芽胞的示教片。2．器材及其他：光學顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。【實驗內容】一、細菌基本形態(tài)和特殊構造的觀察1．細菌的基本形態(tài)（各種球菌、桿菌、弧菌等）觀察要點：注意細菌的染色性、相對大小、形狀及排列方式。2．特殊結構的觀察（莢膜、芽胞、鞭毛）觀察要點：注意這些特殊結構的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細菌的鑒定。二、光學顯微鏡油鏡的使用1．光學顯微鏡的構造光學顯微鏡是觀察細菌形態(tài)最常用的一種儀器，其構造分為機械部分和光學部分，機械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、鏡頭轉換器、調焦裝置等；光學部分包括：接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖11）。圖11 光學顯微鏡的構造顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數(shù)依次增高，其識別方法為：（1）低倍鏡：鏡頭標志為10或10/，鏡頭最短，其上?？逃悬S色環(huán)圈。（2）高倍鏡：鏡頭標志為40或40/，鏡頭較長，其上?？逃兴{色環(huán)圈。（3）油鏡：鏡頭標志為100或 100/，鏡頭最長，其上?？逃邪咨h(huán)圈，或“oil”字樣。 2．油鏡的使用原理圖12 顯微鏡油鏡的使用原理油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標本片透過的光線，因玻片和空氣的折光率不同（玻璃n=，空氣n=），部分光線經(jīng)載玻片進入空氣后發(fā)生折射，不能進入接物鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=），則使進入油鏡的光線增多，視野光亮度增強，物象清晰（見圖12）。 3．使用方法（1）采光：使用顯微鏡時必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當位置。將低倍鏡轉到中央并對準下面的聚光器，打開光圈，轉動反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光源時，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時用平面反光鏡）。根據(jù)所觀察的標本，通過升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。當用低倍鏡或高倍鏡觀察時，應適當縮小光圈，下降聚光器；當用油鏡觀察時，光線宜強，應把光圈完全打開，并將聚光器上升到最高位置。（2）低倍鏡調焦：將欲觀察的標本置載物臺上，用彈簧夾和推進器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺至不能升高為止。用左眼觀察接目鏡，緩慢調節(jié)粗調節(jié)器，使載物臺下降，待看到模糊的圖像時，再調節(jié)細調節(jié)器，直至看到清晰的圖像為止。（3）油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調至清晰之后，轉開物鏡頭，在玻片的標本上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉換至中央，緩慢調節(jié)粗調節(jié)器，使鏡頭浸入油中，當油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉動（從側面觀察），邊觀察接目鏡邊輕輕轉動粗調節(jié)器（此時只能上升鏡頭，不能下降，防止壓壞玻片及損壞物鏡），待看到模糊物象時改調細調節(jié)器，直至找到清晰物象。鏡檢時應將標本按一定方向呈“弓”形移動，直至整個標本觀察完畢，以防漏檢。觀察時應將兩只眼睛同時睜開，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。標本觀察完畢后，先將物鏡頭移開，再轉動粗調節(jié)器使載物臺下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈。4．注意事項（1）顯微鏡是精密光學儀器，在搬放時應右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。（2）顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時與臺面接觸，這樣震動過大，透鏡和微調節(jié)器的裝置易損壞。（3）避免強酸、強堿、氯仿、乙醚、酒精等化學藥品與顯微鏡接觸，避免日光直射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內。更換接物鏡時，卸下后應倒置在清潔的臺面上，并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內。（5）細調節(jié)器是顯微鏡最精細而脆弱的部分，不要向一個方向連續(xù)轉動數(shù)周，應輕微地來回旋轉。（6）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用完后應立即用擦鏡紙拭去香柏油。若油鏡鏡頭上的油跡未擦干凈，應先將1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇醚混合液或二甲苯擦凈。（7）顯微鏡擦凈后，取下標本片，下降聚光器，再將物鏡轉成“品”字形，送至顯微鏡室放入鏡箱內。三、暗視野顯微鏡1．構造與原理：在顯微鏡上安裝一個特制的聚光器一暗視野聚光器。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。這樣，從聚光器周邊斜射到載玻片上細菌等微粒上的光線，就因散射作用而發(fā)出亮光，反射到鏡簡內。故在強光照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)亮的菌體。正如我們在暗室內，能看到從隙縫漏入的陽光內，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。2．使用方法：（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。（2）先用低倍物鏡觀察，調節(jié)光環(huán)置中央后，在暗視野聚光器表面滴