【正文】 ，先將焦性沒食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗布中，再滴入NaOH，立即將接種細(xì)菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置35℃溫箱培養(yǎng)。C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。（750mmHg），再充入無氧氮?dú)猓磸?fù)三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無氧狀態(tài)，則指示劑美藍(lán)為無色。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。隨著缸內(nèi)蠟燭燃燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時(shí)缸內(nèi)的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。大多數(shù)細(xì)菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長速度慢的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。（5）平板劃線時(shí)注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40176。操作時(shí)不宜說話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細(xì)菌污染培養(yǎng)基。6．傾注培養(yǎng)法此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。（1）活菌計(jì)數(shù)：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細(xì)菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。二、細(xì)菌的接種方法1．液體培養(yǎng)基的接種 該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。（4）在加熱溶化時(shí)注意溶液不能溢出瓶外，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水分蒸發(fā)，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進(jìn)入培養(yǎng)基中，；。（7）鑒定 包括兩項(xiàng)內(nèi)容：1）無菌試驗(yàn)：將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h，無菌生長為合格。2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質(zhì)配制的培養(yǎng)基滅菌。3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱將試管直立凝固。（5）分裝　根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進(jìn)行包扎。計(jì)算：，現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基，需加入NaOH的量為：5∶1000=∶X，則X=（1000）/5=30ml為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，則需3ml。比色法：取3支與標(biāo)準(zhǔn)管口徑相同的試管，按下表加樣。（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯中加入少量蒸餾水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。如用干烤法應(yīng)注意控制溫度和時(shí)間在160~170℃2h，以免燒焦棉塞及外包的紙張等。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應(yīng)直立并扎成捆，以免滅菌時(shí)傾倒。在消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起消毒或滅菌，以免加熱時(shí)有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。 2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、常用玻璃器材的洗滌和準(zhǔn)備1．玻璃器材的洗滌 玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化學(xué)物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，如在pH3時(shí)可發(fā)生酸凝集。2．熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。圖21 懸滴法 3．暗視野顯微鏡觀察將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動(dòng)。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。結(jié)果：菌體染成藍(lán)綠色，異染顆粒染成藍(lán)黑色。3），水洗。3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。3）復(fù)染：用堿性美藍(lán)染1min，水洗，待干、鏡檢。3．芽胞染色法（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10~15min后，將玻片微傾斜，用蒸餾水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時(shí)從酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。5．醫(yī)學(xué)意義：通過革蘭染色有助于細(xì)菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，了解細(xì)菌的致病性。（2）脫色時(shí)間長短要適宜，如果涂片較厚應(yīng)相應(yīng)的延長脫色時(shí)間，如涂片較薄則相應(yīng)的縮短脫色時(shí)間，脫色時(shí)應(yīng)不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可。固定的目的在于殺死細(xì)菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖洗掉，通過固定還可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對染料的通透性，使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著色。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。二、革蘭染色1．染色原理（1）等電點(diǎn)學(xué)說：革蘭陽性菌的等電點(diǎn)（pI2～3）比革蘭陰性菌（pI4～5）低，在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。3．其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等。3．熟悉不染色標(biāo)本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。3．注意事項(xiàng)（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時(shí)一經(jīng)開啟不宜中斷，斷電后需待汞燈冷卻后（約15min）方能再啟用。（2）濾光片：1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以便觀察標(biāo)本和保護(hù)眼睛。2．使用方法：（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。此聚光器中央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗。（6）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用完后應(yīng)立即用擦鏡紙拭去香柏油。（3）避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氯仿、乙醚、酒精等化學(xué)藥品與顯微鏡接觸，避免日光直射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。觀察時(shí)應(yīng)將兩只眼睛同時(shí)睜開，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標(biāo)本置載物臺(tái)上，用彈簧夾和推進(jìn)器固定，將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺(tái)至不能升高為止。 3．使用方法（1）采光：使用顯微鏡時(shí)必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當(dāng)位置。（2）高倍鏡：鏡頭標(biāo)志為40或40/，鏡頭較長，其上?？逃兴{(lán)色環(huán)圈?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊構(gòu)造的觀察1．細(xì)菌的基本形態(tài)（各種球菌、桿菌、弧菌等）觀察要點(diǎn)：注意細(xì)菌的染色性、相對大小、形狀及排列方式。2．掌握細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。實(shí)驗(yàn)室管理者應(yīng)對實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)級別進(jìn)行分析，尤其對風(fēng)險(xiǎn)級別較高的、接觸高危標(biāo)本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學(xué)室予以高度重視，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作人員和環(huán)境的安全。建立健全了各項(xiàng)生物安全制度，還應(yīng)成立生物安全管理領(lǐng)導(dǎo)小組，加強(qiáng)生物安全制度實(shí)施情況的監(jiān)督管理，實(shí)驗(yàn)室入口處須粘貼生物安全標(biāo)志，注明危險(xiǎn)因素，生物安全級別，負(fù)責(zé)人姓名和電話，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，如需參觀實(shí)驗(yàn)室等特殊行為需經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)后方可進(jìn)入。（9）有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。（6）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免反光和強(qiáng)光。（2）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)設(shè)置洗手池，宜設(shè)置在靠近出口處。四級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL4）適用于對人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。2．生物安全實(shí)驗(yàn)室分級與要求由于各種病原微生物的危險(xiǎn)度等級不同，因此實(shí)驗(yàn)室必須達(dá)到相應(yīng)的生物防護(hù)等級才能開展有關(guān)實(shí)驗(yàn)。三、生物安全防護(hù)知識簡介醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標(biāo)本，這些標(biāo)本往往是各種細(xì)菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實(shí)驗(yàn)人員感染，還是造成實(shí)驗(yàn)室和周圍環(huán)境的污染，都將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。（2）化學(xué)藥品腐蝕傷：若為強(qiáng)酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和；若為強(qiáng)堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經(jīng)上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)標(biāo)記清楚后送到指定地點(diǎn)。不準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙、飲水和進(jìn)食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活動(dòng)，以免引起風(fēng)動(dòng)。（1）試驗(yàn)前須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒎椒ê妥⒁馐马?xiàng)，做到心中有數(shù)，避免發(fā)生錯(cuò)誤，提高實(shí)驗(yàn)效率。3．通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步掌握臨床常見病原微生物的生物學(xué)性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方法、各種臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法。2．在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術(shù)。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則，建立無菌觀念，嚴(yán)格無菌操作，防止實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)意外情況，并確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室的安靜、整潔和有序。禁止將本實(shí)驗(yàn)室的物品帶出實(shí)驗(yàn)室外。2．實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理方法（1）發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進(jìn)行消毒，立即進(jìn)行醫(yī)療處理。（5）菌液污染環(huán)境：將適量2~3%%新潔爾滅浸泡污染面半小時(shí)后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗凈。基于以上劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預(yù)防和治療措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)需要達(dá)到的生物安全實(shí)驗(yàn)室級別做了詳細(xì)分類，各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)均需參照此標(biāo)準(zhǔn)。三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL3）適用于有明顯危害、可以通過空氣傳播的病原微生物（如結(jié)核桿菌、伯氏立克次體等），通常已有預(yù)防傳染的疫苗，該級別實(shí)驗(yàn)室除了有嚴(yán)格的一級和二級安全設(shè)施要求外，還需具備合適的空氣凈化系統(tǒng)。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則》，二級生物安全實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)施需符合以下幾點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)室需具有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的設(shè)計(jì)，有可開啟的窗戶，有紗窗，實(shí)驗(yàn)室門有可視窗帶鎖并能自動(dòng)關(guān)閉。（5）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)能防水、耐腐蝕、耐熱。（8）有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)施，如高壓蒸汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置、應(yīng)急噴淋裝置、急救藥箱、滅火器等。3．實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度實(shí)驗(yàn)室生物安全制度建設(shè)對于臨床實(shí)驗(yàn)室而言是生物安全防護(hù)的核心，實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度應(yīng)包括：實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入制度、生物安全培訓(xùn)制度、生物安全責(zé)任制和責(zé)任追究制度、生物防護(hù)與安全制度、安全檢查制度、個(gè)人防護(hù)制度、實(shí)驗(yàn)室管理制度、清潔消毒制度、安全計(jì)劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報(bào)告制度、生物安全防護(hù)應(yīng)急預(yù)案、標(biāo)準(zhǔn)操作程序等。因此，實(shí)驗(yàn)室人員必須提高生物安全意識，認(rèn)真學(xué)習(xí)生物安全相關(guān)的各種法規(guī)和文件，定期進(jìn)行生物安全防護(hù)知識培訓(xùn)，熟悉生物防護(hù)有關(guān)知識，加強(qiáng)基本技能的培養(yǎng)，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。第一章 微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡的使用【目的和要求】1．熟悉微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)則并自覺遵守。2．器材及其他：光學(xué)顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。圖11 光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數(shù)依次增高，其識別方法為：（1）低倍鏡：鏡頭標(biāo)志為10或10/，鏡頭最短，其上常刻有黃色環(huán)圈。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=），則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野光亮度增強(qiáng)，物象清晰（見圖12）。當(dāng)用低倍鏡或高倍鏡觀察時(shí)，應(yīng)適當(dāng)縮小光圈，下降聚光器；當(dāng)用油鏡觀察時(shí)，光線宜強(qiáng)，應(yīng)把光圈完全打開，并將聚光器上升到最高位置。鏡檢時(shí)應(yīng)將標(biāo)本按一定方向呈“弓”形移動(dòng)，直至整個(gè)標(biāo)本觀察完畢，以防漏檢。（2）顯微鏡放到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上時(shí)，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時(shí)與臺(tái)面接觸，這樣震動(dòng)過大，透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置易損壞。（5）細(xì)調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細(xì)而脆弱的部分，不要向一個(gè)方向連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)周，應(yīng)輕微地來回旋轉(zhuǎn)。三、暗視野顯微鏡1．構(gòu)造與原理：在顯微鏡上安裝一個(gè)特制的聚光器一暗視野聚光器。正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。四、熒光顯微鏡1．構(gòu)造：（1）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用150~200瓦高壓汞燈。操作同光學(xué)顯微鏡。2．掌握革蘭染色的方法、原理、結(jié)果觀察及意義。2．試劑：革蘭染色液、細(xì)胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。大部分細(xì)菌染色的基本程序