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微生物學(xué)及實驗實驗指導(dǎo)書-在線瀏覽

2025-05-22 23:23本頁面
  

【正文】 鏡頭上的鏡油,然后用擦鏡紙蘸取少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上殘留的油跡,最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。同時把聚光鏡降下,以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。同時注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。六、思考題 用油鏡觀察時應(yīng)注意哪些問題?在載玻片和鏡頭之間加滴什么油?起什么作用? 試列表比較低倍鏡、高倍鏡及油鏡各方面的差異。 根據(jù)你觀察到的活性污泥中的微生物種類,說明水質(zhì)污泥情況。實驗?zāi)康? 2細(xì)菌的細(xì)胞小而透明,在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別,必須對它們進行染色。此法操作簡便,適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對比,在顯微鏡下更易于識別。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時,細(xì)菌所帶正電荷增加,此時可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。其目的有二:一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上;二是增加其對染料的親和力。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。材料 菌種 枯草芽孢桿菌12~18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、面包酵母瓊脂斜面培養(yǎng)物。染色劑 呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液),石炭酸復(fù)紅染液。 4 5若用菌懸液(或液體培養(yǎng)物)涂片,可用接種環(huán)挑取2~3環(huán)直接涂于載玻片上。 干燥 室溫自然干燥。但切勿離火焰太近,因溫度太高會破壞菌體形態(tài)。涂片、干燥和熱固定。呂氏堿性美藍(lán)染色1~2min,石炭酸復(fù)紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min水洗時,不要水流直接沖洗涂面。 干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以(注意勿擦去菌體)。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。結(jié)果 繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。實驗?zāi)康? 2Gram氏創(chuàng)立的,革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性,是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。碘作為媒染劑,它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫碘的復(fù)合物,從而增強了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成,壁厚、類脂質(zhì)含量低,用乙醇(或丙酮)脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小,透性降低,從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi),經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。 3subtilis)約16h牛肉膏瓊脂斜面菌種一支。儀器或其他用具 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蒸餾水、香柏油、二甲苯。流程 涂片→干燥→固定→染色(初染→媒染→脫色→復(fù)染)→鏡檢。玻片要潔凈無油,否則菌液涂不開。傾去染色液,細(xì)水沖洗至洗出液為無色,將載玻片上水甩凈。min 脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水,將玻片傾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脫色,直至流出的乙醇無紫色時,立即水洗,終止脫色,將載玻片上水甩凈。脫色不足,陰性菌被誤染成陽性菌,脫色過度,陽性菌被誤染成陰性菌。 復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約2~3min在染色的過程中,不可使染液干涸。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。實驗結(jié)束后處理 清潔顯微鏡。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗,涼干后備用。 (菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng))。哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性?其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么? 2. 進行革蘭氏染色時,為什么特別強調(diào)菌齡不能太老,用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題? 3. 革蘭氏染色時,初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復(fù)染之前,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色? 4.你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時,應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)? 6.如果涂片未經(jīng)熱固定,將會出現(xiàn)什么問題?加熱溫度過高、時間太長,又會怎樣呢? 實驗三 培養(yǎng)基的制備和滅菌實驗項目性質(zhì):基礎(chǔ)驗證實驗所屬課程名稱:《微生物學(xué)及實驗》實驗計劃學(xué)時:3學(xué)時一、實驗?zāi)康摹⒎盅b方法;。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型,對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同,加之實驗和研究的目的不同,所以培養(yǎng)基的種類很多,使用的原料也各有差異,但從營養(yǎng)角度分析,培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì),是應(yīng)用最廣的凝固劑。但多次反復(fù)融化,其凝固性降低。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。 藥品試劑 流程 稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板。培養(yǎng)基的制備 稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品,放入適當(dāng)大小的燒杯中,瓊脂不要加入。 溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中,在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱,并用玻棒攪拌,以防液體溢出。如果配方中有淀粉,則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀,并在火上加熱攪拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,補足水分。測定pH可用pH試紙或酸度計等。瓊脂加入后,置電爐上一面攪拌一面加熱,直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌,并補足水分(水需預(yù)熱)。 過濾分裝 分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口,以免浸濕棉塞, 引起污染。固體分裝量為管高的1/5,半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜;分裝三角瓶,其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱,制備組別和姓名、日期等。普通培養(yǎng)基為121℃20min,以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基,于水浴鍋中冷卻到45~50℃,立刻倒平板。本實驗主要介紹物理方法的一種,即加熱滅菌。通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān),含水量越高,其凝固所需要的溫度越低。 濕熱滅菌 煮沸消毒法 :注射器和解剖器械等均可采用此法。對于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約15~30min,對于芽孢則需煮沸約1~2h。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。立式消毒鍋最好用已煮開過的水,以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。 裝料、加蓋:滅菌材料放好后,關(guān)閉滅菌器蓋,采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋,使蒸汽鍋密閉,勿使漏氣。用電爐加熱,待水煮沸后,水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出,當(dāng)有大量蒸汽排出時,維持5min,使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。當(dāng)壓力上升至所需壓力時,控制電壓以維持恒溫,并開始計算滅菌時間,待時間達(dá)到要求(一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃,20min)后,停止加熱,待壓力降至接近“0”時,打開放氣閥。 滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng):滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長,可保存?zhèn)溆?;斜面培養(yǎng)基取出后,立即擺成斜面后空白培養(yǎng);半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后,空白培養(yǎng)。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后,放入電烘箱中烘烤,即加熱至160~170℃維持1~2h。凡帶有膠皮的物品,液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下:平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi);三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙,用棉繩以活結(jié)扎緊,以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染;吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心,輕輕捅入管口,松緊必須適中,管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過火焰燒去,滅菌時將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進行滅菌,也可用紙條斜著從吸管尖端包起,逐步向上卷,頭端的紙卷捏扁并擰幾下,再將包好的吸管集中滅菌。將烘箱的溫度升至160~170℃并恒溫1~2h,注意勿使溫度過高,超過170℃,器皿外包裹的紙張、棉花會被烤焦燃燒。溫度降至60~70℃時方可打開箱門,取出物品,否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。 火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌,迅速徹底。此外,在接種過程中,試管或三角瓶口,也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的。 試述高壓蒸汽滅菌的過程及注意事項。 高壓蒸汽滅菌時應(yīng)注意哪些事項? 實驗四 純種微生物的分離、轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)實驗項目性質(zhì):基礎(chǔ)驗證性實驗所屬課程名稱:《微生物學(xué)及實驗》實驗計劃學(xué)時:3學(xué)時一、 二、實驗原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件,如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長,而抑制其他微生物生長的環(huán)境,從而淘汰一些不需要的微生物。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。因此,純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外,還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定,有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。因此土壤是微生物多樣性的重要場所,是發(fā)掘微生物資源的重要基地,可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。 將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進行接種。三、實驗材料 1普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。2 3酒精燈,玻璃鉛筆,火柴,試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。 步驟
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