微生物學(xué)實驗[最終定稿]-在線瀏覽
2024-10-29 04:07本頁面
【正文】 存活率，請設(shè)計1～2種可行的檢測方法。（二）、基本原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細(xì)胞。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。（三）器材1．菌種 大腸桿菌菌懸液。3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。(稀釋度)各3套。2．稀釋用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，此即為10倍稀釋。OptionsEmail Replies將101試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。……其余依次類推，整個過程如圖153所示。3，取樣用三支1mL無菌吸管分別吸取10105和106。，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。5．計數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)5一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。實際工作中同一稀釋度重復(fù)對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。(4)當(dāng)你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認(rèn)為問題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結(jié)果?三 光電比濁計數(shù)法一、目的要求1．了解光電比濁計數(shù)法的原理。二、基本原理當(dāng)光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，菌體計數(shù)可采用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，平板菌落計數(shù)或細(xì)胞干重測定等方法。光電比濁計數(shù)法的優(yōu)點是簡便、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。因此，對于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測定。（四）操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為7。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表管號12345678細(xì)胞數(shù)106/ml光密度（OD）每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定(4)以光密度(OD)值為縱坐標(biāo)，以每毫升細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。3．根據(jù)所測得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)。2．復(fù)習(xí)光電比濁法測量細(xì)菌數(shù)量的方法。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期，對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。用于測定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的方法已在上述實驗作了介紹。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖155)測定“klett units”值的光度計。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/。3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。2．接種(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌大試管中。4．比濁測定用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進(jìn)行光電比濁測定。本操作步驟也可用簡便的方法代替：1．~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點，測定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。2．分別在培養(yǎng)0、1116和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測定OD值。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準(zhǔn)確度愈高。2．思考題(1)如果用活菌計數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會有什么不同？兩者各有什么優(yōu)缺點？(2)細(xì)菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細(xì)胞密度為103/ml，其密度高達(dá)2108/ml，計計算出其代時。無故一次不到扣除1分。實驗前洗手，保持試驗臺清潔，保持室內(nèi)安靜。實驗過程中，嚴(yán)格按正確方法操作實驗儀器。實驗過程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃品接近火焰。每次實驗完成后，清潔試驗臺，各種物品放回原位。由于操作不當(dāng)損壞玻璃器皿，先登記姓名，并扣分，每件1分。三、微生物學(xué)實驗成績評定基礎(chǔ)和綜合實驗80%每次實驗5分，其中實驗操作3分，實驗報告2分實驗考試10%實驗理論和實驗操作各為5分自主設(shè)計實驗10%包括實驗設(shè)計、實驗操作、實驗結(jié)果、匯報交流，共10分
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