【正文】 ）2 → PbS↓+ 2CH3COOH （黑色）實驗器材： 1．菌種 枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)，大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通變形桿菌（Proteus vularis），產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）。有些細(xì)菌能分解含硫的有機(jī)物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。溴麝香草酚藍(lán)的指示范圍為：。有些細(xì)菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產(chǎn)氣腸桿菌；而另一些細(xì)菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。有時為了使反應(yīng)更為明顯，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。因此大腸桿菌為陽性反應(yīng)，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價值的。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中若超過一定數(shù)量，則表示受糞便污染。IMViC是吲哚(indol test)、甲基紅(methy1 red test)、伏一普(VogesProkauer test)和檸檬酸鹽(citrate test)四個試驗的縮寫，i是在英文中為了發(fā)音方便而加上的。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（）變?yōu)辄S色()。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異。而在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基的pH升高，指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(Proteus)的細(xì)菌要慢，因此尿素酶試驗被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個屬的成員。尿素是由大多數(shù)哺乳動物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物。氨基酸的分解會引起堿性反應(yīng)，使石蕊變?yōu)樽仙?。酪素水解成氨基酸和肽后，培養(yǎng)基就會變得透明。還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測。而在25℃以上明膠就會液化。微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外，當(dāng)缺乏糖類物質(zhì)時，亦可用它們作為碳源和能源。這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實：淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍(lán)色，但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。3．了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。2．了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。5．為什么高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？實驗六 微生物的生理生化反應(yīng)實驗?zāi)康模?．證明不同微生物對各種有機(jī)大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2．為什么高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？3．在三種不同的平板上你分離得到哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征。實驗報告：1．2．平板劃線分離法(1)倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，土樣編號和實驗日期；(2) 劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述101的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。(5) 挑菌落 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是為單一的微生物。(3) 涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上104，105，106三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由104，105，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基；(2) 制備土壤稀釋溶液 稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶，振動約20min，使土樣與水分混合，將細(xì)胞分散。4．儀器或者其他用具 無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計數(shù)板等。2．培養(yǎng)基 高氏Ⅰ號培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定。本實驗采用平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，包括兩個方面1．選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；2． 微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。實驗原理：從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。因紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。（2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%～3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。如果不超過4個，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時間或同時加強(qiáng)其他措施。共做三套。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力?！妫?0min滅菌。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。2．放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。二 高壓蒸氣滅菌1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。5．開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。3．恒溫當(dāng)溫度升達(dá)到160～170℃時，恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。當(dāng)溫度升至100℃時，關(guān)閉排氣孔。物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。3．儀器或其他用具 培養(yǎng)皿，試管，吸管，電烘箱，培養(yǎng)皿(6套一包)， 手提式高壓蒸氣滅菌鍋，紫外線燈等。實驗器材：1．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線殺菌機(jī)理主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式和手提式二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。（8Ib/）℃滅菌15min，但為了保證效果，, 滅菌20min,然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見（表3）表3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/℃2/3空氣排出時的溫度/℃1/2空氣排出時的溫度/℃1/3空氣排出時的溫度/℃空氣全不排出時的溫度/℃MpaKg/cm2Ib/in2510094907210109105100901．0515115112109100201211181151092512612412111530130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=；1Ib/in2=.（相當(dāng)于15 Ib/），℃，15～30min可達(dá)到徹底滅菌的目的。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表1），二是濕熱的穿透力比干熱大（表2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。3．了解紫外線滅菌的原理和方法。2．了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。實驗報告：l．配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查?3． 細(xì)菌能在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長嗎？為了分離放線菌，你認(rèn)為應(yīng)該采取什么措施？4． 什么是選擇性培養(yǎng)基？它在微生物學(xué)工作中有何重要性？5． 如果在用馬丁氏培養(yǎng)基分離真菌時，發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，你認(rèn)為是什么原因？你將如何進(jìn)一步分離純化得到所需要的真菌？實驗四 滅菌與消毒實驗?zāi)康模?．了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。可先將鏈霉素配成1%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于20℃)，在100mL培養(yǎng)基中加1% ，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg。2．分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。7H2O ，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂15～20g，水1000mL，自然pH。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。7H2O，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。對微量成分FeSO4l．稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。7H2O ，F(xiàn)eSO4其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl ，K2HPO410．無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。然后用記號筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7．包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。5．分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。4．過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。3． 調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達(dá)到所需pH范圍。2．加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。實驗內(nèi)容：（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和