【正文】 么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?3．試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。(二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)吉(一)繪圖1．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。3．脫色時(shí)間十分重要，過長，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽性菌。四、注意事項(xiàng)1. 涂片務(wù)求均勻，切忌過厚。(三)結(jié)果革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。4．復(fù)染 滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。2．媒染 滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。此制片可用于染色。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。 2．進(jìn)行革蘭氏染色法操作。目的：初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。七、問題和思考1．涂片在染色前為什么要先進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么問題?2．制備染色裝片時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察?3．你知道口腔中通常存在哪些微生物嗎?如何進(jìn)行區(qū)分?2．你所觀察到的口腔微生物的形態(tài)圖，并注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。涂片時(shí)，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。(4)鏡檢：將光線調(diào)亮，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然后推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。(2)將涂片于室溫中自然干燥后，按上面單染色法的步驟，進(jìn)行固定、染色、水洗，干燥后鏡檢。6．干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞(圖7—1C)。3．固定 手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2～3次。三、操作步驟(一)單染色法1．涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～(圖7—1A、B)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌種。內(nèi)容：。實(shí)驗(yàn)7 細(xì)菌單染色法及口腔微生物的觀察(二)試指出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問題?七、問題和思考1．用明視野顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?2．無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?3試設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)的工作方案。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖l．給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖。四、注意事項(xiàng)1．注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙。如菌液過多，可用吸水紙適當(dāng)吸去一部分。3．用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。 1．將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無菌水。 (二)觀察細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察巨大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)、巨大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。 香柏油、二甲苯、無菌水； 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管。3．觀察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色裝片。內(nèi)容：1．觀察細(xì)菌的基本形態(tài)染色裝片。實(shí)驗(yàn)6 細(xì)菌形態(tài)的觀察；。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣（n= ）的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減少鏡口角（圖5—2A）。 從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間最小距離（D）的能力。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。2．取出裝片。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。仔細(xì)觀察并繪圖。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對(duì)光至視野內(nèi)均勻明亮為止。坐正，練習(xí)用左眼觀察。香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。 2．用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。菌落濕潤：正反面顏色一致小大而扁平…………小而扁平…… 細(xì)菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌753表4—2 未知菌菌落的形態(tài)菌落號(hào)濕干菌落描述判斷結(jié)果厚薄大小松密大小表面邊緣隆起形狀顏色正面反面水溶性色素透明度121球孢白僵菌霉菌產(chǎn)黃青霉放線菌細(xì)黃鏈霉菌粘紅酵母枯草桿菌七、問題和思考1．試比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌菌落形態(tài)的差異?2．設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，檢測實(shí)驗(yàn)室空氣環(huán)境中的微生物類別?表4—1 已知菌菌落的形態(tài)微類生物數(shù)菌名辯別要點(diǎn)菌落描述濕干表面邊緣隆起形狀顏色透明度厚薄大小松密大小正面反面 水溶性色素細(xì)菌大腸桿菌五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．已知菌落的形態(tài)特征記錄于表4～1中。(三)直接觀察菌落直接用實(shí)驗(yàn)3中的“土壤稀釋分離”獲得的單菌落進(jìn)行觀察識(shí)別，并將結(jié)果填入表42中。3．培養(yǎng) 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3d，將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～5d，即可獲得未知菌的單菌落。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，酵母菌于28℃培養(yǎng)2～3d，霉菌和放線菌置28℃培養(yǎng)5～7d，待長成菌落后，仔細(xì)觀察四大類微生物菌落的形態(tài)特征，并將觀察結(jié)果記錄于表41中。3．制備單菌落 通過平板劃線法獲得細(xì)菌、酵母菌和放線菌的單菌落。三、操作步驟(一)制備已知菌的單菌落1．制備平板 將已融化的無菌培養(yǎng)基待冷卻至50℃左右，分別制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板和高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板各一皿。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、無菌水。2．根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：識(shí)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌四大類微生物的菌落特征。七、問題和思考1．在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?2．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算方法：選擇長出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，按以下公式：總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)2．分別記錄平板劃線、斜面接種的結(jié)果，并自我評(píng)價(jià)。3．放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。四、注意事項(xiàng)1．一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。圖3—4 斜面接種（A）及穿刺接種（B）示意圖（3）接種后30℃ 恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)48h，放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。（三）斜面接種和穿刺接種1．斜面接種（1）取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標(biāo)記（寫上菌名、接種日期、接種人等），然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面上。C. 用于較濃的菌樣, 分?jǐn)?shù)次劃線, 每次劃線后要燒接種環(huán), 然后再劃下一區(qū)。圖3—3 平板劃線方法示意圖A. 劃線分離操作。2．劃線分離 使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落，主要方法參見圖3—3。（二）平板制作及劃線分離方法。4．培養(yǎng) 將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28～30℃中恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)1～2d，放線菌培養(yǎng)5～7d，霉菌培養(yǎng)3～5d。（3）霉菌：取10103兩管稀釋各1mL，分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中(～2mm為宜)，迅速輕輕搖動(dòng)平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板。(2)稀釋：，如此重復(fù)，可依次制成103～108的稀釋液(圖31)。三、操作步驟(一)土壤稀釋分離1．取土壤 取表層以下5—10cm處的土樣，放入無菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。已滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶，(帶玻璃珠)1瓶，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。3．學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術(shù)。內(nèi)容：l．用稀釋法分離細(xì)菌、放線菌和霉菌。實(shí)驗(yàn)3 土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術(shù)（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告 l．結(jié)果記錄無菌檢查結(jié)果2．思考題(1)你做的過濾除菌實(shí)驗(yàn)效果如何?如果經(jīng)培養(yǎng)檢查有雜菌生長，你認(rèn)為是什么原因造成的?(2)如果你需要配制一種含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其抗生素的終濃度(或工作濃度)為50μg/ml，你將如何操作?(3)過濾除菌應(yīng)注意哪些問題? 5．清洗棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，并換上一張新的微孔濾膜，組裝包扎，再經(jīng)無菌后使用。3．壓濾將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭撥出。2．連接將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。2．儀器或其他用具 注射器，微孔濾膜過濾器，無菌試管，鑷子，玻璃刮棒。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。（二）基本原理過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。（1）細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)菌芽孢對(duì)紫外線和的抵抗力會(huì)一樣嗎，為什么？（2）你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通燈用玻璃？（3）在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，為什么要隔一塊普通玻璃？四 微孔濾膜過濾除菌（一）目的要求1．了解過濾除菌的原理。2%～3%來蘇爾+紫外線照射（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)1 2 3滅菌效果比較紫外線照射3%～5%石炭酸+紫外線照射 （3）檢查滅菌效果[方法同“單用紫外線照射”(3)]。 2．化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。 （3）檢查每個(gè)平板上生長的菌落數(shù)。置37℃培養(yǎng)24h。（四）操作步驟l．單用紫外線照射（1）在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關(guān)，照射30min，將開關(guān)關(guān)閉。2．溶液或試劑 3%~5%石炭酸或2%~3%來蘇爾溶液。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化