【正文】 3次固定。 (4) 在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。2．供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 細(xì)黃鏈霉菌(streptomycs micuoflavus)又稱5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃紙培養(yǎng)平皿。制片時(shí)，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。用油鏡觀察。注：(一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1．插片法(1)制平板、接種：用冷卻至約50℃的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法接菌：先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種(接種量可適當(dāng)加大)；先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進(jìn)行。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。圖11—1 放線菌的插片與搭片培養(yǎng)示意圖A. 插片法； B. 搭片法2．制平板及鋪玻璃紙 取冷凝后的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將預(yù)先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)表面，鋪玻璃紙時(shí)可用無菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基之間的氣泡除去。2．觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。死亡率=死細(xì)胞總數(shù)247。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。六、問題和思考1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2．如何區(qū)別營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和釋放出的子囊孢子?3．試設(shè)計(jì)一個(gè)從子囊中分離子囊孢子的試驗(yàn)方案。3．根霉假根的觀察。3．加培養(yǎng)基 用無菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，(滴加量一般以l/2小滴為宜)。 將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。四、注意事項(xiàng)載玻片濕室培養(yǎng)時(shí)，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察。三、操作步驟 l．測(cè)微尺的構(gòu)造 顯微鏡測(cè)微尺是由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)接物測(cè)微尺組成，目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。兩條重合線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)一般測(cè)量菌體的大小，應(yīng)測(cè)定10～20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。2．菌體大小測(cè)定結(jié)果：菌號(hào)大腸桿菌測(cè)定結(jié)果金黃色葡萄球菌的直徑大小測(cè)定結(jié)果目鏡測(cè)微尺格數(shù)實(shí)際長(zhǎng)度目鏡測(cè)微尺格數(shù) 實(shí)際直徑/181。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l51。圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（一） 圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（二）A. 正面圖；； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室；2. 蓋玻片；
。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、PeteroffHauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。高倍鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度是 μm。并詳細(xì)記錄于表15—1中。3．計(jì)算方法標(biāo)定公式：二、實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的玻片標(biāo)本。六、問題和思考1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點(diǎn)?2．濕室培養(yǎng)時(shí)為何用20%甘油作保濕劑?3．本實(shí)驗(yàn)中觀察假根的設(shè)計(jì)原理是什么?此設(shè)計(jì)還適合于培養(yǎng)哪類菌。4．制成永久裝片 把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標(biāo)本作較長(zhǎng)期保存。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)（圖13—1）。2．接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。內(nèi)容：1．霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。2．?dāng)?shù)個(gè)子囊及子囊孢子形態(tài)圖。可見到芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2)。(2)轉(zhuǎn)接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀酒酵母轉(zhuǎn)接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)14d。(3)在一個(gè)視野里計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計(jì)數(shù)5～6個(gè)視野。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d（圖11—1B）。2．試比較5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同。2．印片染色法觀察 用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長(zhǎng)有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動(dòng)而破壞放線菌的自然形態(tài)。(二)水封片觀察取一滴美藍(lán)染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個(gè)分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：辨認(rèn)放線菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學(xué)習(xí)放線菌的觀察方法。背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。圖9—1 懸滴標(biāo)本的制備(3)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(3)將殘水瀝干或用B液沖去殘水。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具普通變形菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。六、問題和思考1．涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么?2．什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?3．試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。四、注意事項(xiàng)1. 涂片務(wù)求均勻，切忌過厚。此制片可用于染色。 2．進(jìn)行革蘭氏染色法操作。涂片時(shí)，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。6．干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌種。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖l．給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖。 1．將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無菌水。內(nèi)容：1．觀察細(xì)菌的基本形態(tài)染色裝片。 4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。菌落濕潤(rùn)：正反面顏色一致小大而扁平…………小而扁平…… 細(xì)菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌5球孢白僵菌枯草桿菌五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．已知菌落的形態(tài)特征記錄于表4～1中。3．制備單菌落 通過平板劃線法獲得細(xì)菌、酵母菌和放線菌的單菌落。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：識(shí)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌四大類微生物的菌落特征。四、注意事項(xiàng)1．一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。（3）霉菌：取10103兩管稀釋各1mL，分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。三、操作步驟(一)土壤稀釋分離1．取土壤 取表層以下5—10cm處的土樣，放入無菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。實(shí)驗(yàn)3 土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術(shù)2．連接將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。（二）基本原理過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)1 2 3滅菌效果比較紫外線照射3%～5%石炭酸+紫外線照射置37℃培養(yǎng)24h。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長(zhǎng)，即可待用。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。（四）操作步驟1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。圖2—2B 手提式滅菌鍋1. 安全閥。表2—1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/℃50562574～801880～9061450160～170在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。2．學(xué)習(xí)高壓蒸氣滅菌的操作方法。3．恒溫當(dāng)溫度升達(dá)到160～170℃時(shí)，恒溫調(diào)節(jié)器會(huì)自動(dòng)控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。 。 。 3．鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45℃左右時(shí)才能加入。2．pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查 同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。7H2O ，瓊脂15～20g，水1000mL，～。8．滅菌 ℃濕熱滅菌20min。6．加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，～ 1．稱藥品 　按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。2．高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制。. . . . .內(nèi)容：1．牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配制。三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。然后用記號(hào)筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7H2O ，F(xiàn)eSO4如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2．分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。干熱滅菌使用的電烘箱的結(jié)構(gòu)如圖21。 。 12. 保溫室。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160—170℃溫度，則需轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)器使紅燈再亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需溫度。二 高壓蒸氣滅菌（一）目的要求1．了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。實(shí)驗(yàn)中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式（圖22，A）和手提式（圖2—2，B）二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實(shí)驗(yàn)以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。 （三）器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。4．用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。O3和H2O2均有殺菌作用。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。 因紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。2．掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。（四）操作步驟l．組裝、滅菌，旋緊壓平，包裝滅菌后待用(，℃滅菌20min)。無菌培養(yǎng)皿12套，1mL無菌移液管10支，土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。 圖3—2 倒平板的方法（2）放線菌：取10104兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5～6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出1mL加入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放線菌平板。（2）接種的方法是，用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新鮮斜面上“之”字形劃線，方向是從下部開始，一直劃至上部（圖3