【正文】 中，便可制成放線菌平板。 圖3—1 稀釋法分離土壤微生物操作過程圖解3. 混菌法測定菌落數(shù)的方法(1)細菌：取10106兩管稀釋液各1mL，分別接人相應(yīng)標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。]注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。無菌培養(yǎng)皿12套，1mL無菌移液管10支，土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。2．用平板劃線方法分離微生物。 壓濾時，用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過淀膠．4．無菌檢查，涂布均勻，置37℃溫室中培養(yǎng)24h，檢查是否有菌生長。（四）操作步驟l．組裝、滅菌，旋緊壓平，包裝滅菌后待用(，℃滅菌20min)。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。2．掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。 因紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。如果不超過4個，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時間或同時加強其他措施。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。（三）器材1．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨平板。O3和H2O2均有殺菌作用。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。4．用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。 （三）器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。 。實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式（圖22，A）和手提式（圖2—2，B）二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。表2—3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/℃2/3空氣排出時的溫度/℃1/2空氣排出時的溫度/℃1/3空氣排出時的溫度/℃空氣全不排出時的溫度/℃MpaKg/cm2Ib/in25100949072101091051009015115112109100201211181151092512612412111530130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=；1Ib/in2=.（相當于15 Ib/），℃,15～30min可達到徹底滅菌的目的。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。二 高壓蒸氣滅菌（一）目的要求1．了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。4．降溫切斷電源、自然降溫。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫，此時如果還未達到所需的160—170℃溫度，則需轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)器使紅燈再亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達到所需溫度。（四）操作步驟1．裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管，吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。 12. 保溫室。 。 。干熱滅菌使用的電烘箱的結(jié)構(gòu)如圖21。2．學習干熱滅菌的操作技術(shù)。調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。2．分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。7H2O ，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂15～20g，水1000mL，自然pH。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。對微量成分FeSO47H2O ，F(xiàn)eSO410．無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。然后用記號筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。5．分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。2．加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3H2O、MgSO4內(nèi)容：1．牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配制。. . . . .第一部分 基礎(chǔ)實驗2．高氏1號培養(yǎng)基的配制。7H2O、FeSO4其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，～ 1．稱藥品 　按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。6．加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。8．滅菌 ℃濕熱滅菌20min。（二）高氏l號培養(yǎng)基的配制高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。7H2O ，瓊脂15～20g，水1000mL，～。7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO42．pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查 同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。1．稱量和溶解 先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中。 3．鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45℃左右時才能加入。不同培養(yǎng)基各有配制特點，要注意具體操作。（二）基本原理干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。圖21 電烘箱的外觀和結(jié)構(gòu) 。 。 。 。物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。3．恒溫當溫度升達到160～170℃時，恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。5．開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。2．學習高壓蒸氣滅菌的操作方法。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。表2—1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/℃50562574～801880～9061450160～170在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。圖2—2B 手提式滅菌鍋1. 安全閥。 。（四）操作步驟1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。2．溶液或試劑 3%~5%石炭酸或2%~3%來蘇爾溶液。置37℃培養(yǎng)24h。 2．化學消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。（五）實驗報告1．結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)1 2 3滅菌效果比較紫外線照射3%～5%石炭酸+紫外線照射（二）基本原理過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。2．連接將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。5．清洗棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，并換上一張新的微孔濾膜，組裝包扎，再經(jīng)無菌后使用。實驗3 土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術(shù)3．學習斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術(shù)。三、操作步驟(一)土壤稀釋分離1．取土壤 取表層以下5—10cm處的土樣，放入無菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中(～2mm為宜)，迅速輕輕搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板。（3）霉菌：取10103兩管稀釋各1mL，分別接入相應(yīng)標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。（二）平板制作及劃線分離方法。C. 用于較濃的菌樣, 分數(shù)次劃線, 每次劃線后要燒接種環(huán), 然后再劃下一區(qū)。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。圖3—4 斜面接種（A）及穿刺接種（B）示意圖（3）接種后30℃ 恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)48h，放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存。四、注意事項1．一般土壤中，細菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細菌時，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計數(shù)。計算方法：選擇長出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進行計數(shù)，按以下公式：總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)2．分別記錄平板劃線、斜面接種的結(jié)果，并自我評價。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：識別細菌、酵母菌、放線菌和霉菌四大類微生物的菌落特征。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、無菌水。3．制備單菌落 通過平板劃線法獲得細菌、酵母菌和放線菌的單菌落。3．培養(yǎng) 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3d，將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～5d，即可獲得未知菌的單菌落。五、實驗報告1．已知菌落的形態(tài)特征記錄于表4～1中?？莶輻U菌放線菌細黃鏈霉菌球孢白僵菌表4—2 未知菌菌落的形態(tài)菌落號濕干菌落描述判斷結(jié)果厚薄大小松密大小表面邊緣隆起形狀顏色正面反面水溶性色素透明度1215菌落濕潤：正反面顏色一致小大而扁平…………小而扁平…… 細菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：復(fù)習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。轉(zhuǎn)動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當視野中有物像出現(xiàn)時，再用細調(diào)節(jié)器校正焦距。重復(fù)觀察時可比第一次少加香柏油。4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。3．使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。 ；。內(nèi)容：1．觀察細菌的基本形態(tài)染色裝片。 香柏油、二甲苯、無菌水； 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管。 1．將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無菌水。如菌液過多，可用吸水紙適當吸去一部分。五、實驗報告(一)繪圖l．給出你所觀察到的幾種細菌的個體形態(tài)視野圖。實驗7 細菌單染色法及口腔微生物的觀察二、實驗材料和用具大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌種。3．固定 手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2～3次。6．干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然后推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。涂片時，滴