【正文】 板劃線方法分離微生物。 壓濾時，用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過淀膠．4．無菌檢查，涂布均勻，置37℃溫室中培養(yǎng)24h，檢查是否有菌生長。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。如果不超過4個，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時間或同時加強其他措施。（三）器材1．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨平板。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。 。表2—3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/℃2/3空氣排出時的溫度/℃1/2空氣排出時的溫度/℃1/3空氣排出時的溫度/℃空氣全不排出時的溫度/℃MpaKg/cm2Ib/in25100949072101091051009015115112109100201211181151092512612412111530130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=；1Ib/in2=.（相當于15 Ib/），℃,15～30min可達到徹底滅菌的目的。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。4．降溫切斷電源、自然降溫。（四）操作步驟1．裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管，吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。 。2．學習干熱滅菌的操作技術(shù)。調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。7H2O ，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂15～20g，水1000mL，自然pH。對微量成分FeSO410．無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。5．分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。2．加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。3H2O、MgSO4第一部分 基礎實驗7H2O、FeSO4若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。（二）高氏l號培養(yǎng)基的配制高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO41．稱量和溶解 先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中。不同培養(yǎng)基各有配制特點，要注意具體操作。（二）基本原理干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。圖21 電烘箱的外觀和結(jié)構(gòu) 。 。物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。5．開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。 。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。2．溶液或試劑 3%~5%石炭酸或2%~3%來蘇爾溶液。 2．化學消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。5．清洗棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，并換上一張新的微孔濾膜，組裝包扎，再經(jīng)無菌后使用。3．學習斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術(shù)。然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中(～2mm為宜)，迅速輕輕搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板。（二）平板制作及劃線分離方法。C. 用于較濃的菌樣, 分數(shù)次劃線, 每次劃線后要燒接種環(huán), 然后再劃下一區(qū)。圖3—4 斜面接種（A）及穿刺接種（B）示意圖（3）接種后30℃ 恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)48h，放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存。計算方法：選擇長出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進行計數(shù)，按以下公式：總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)2．分別記錄平板劃線、斜面接種的結(jié)果，并自我評價。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、無菌水。3．培養(yǎng) 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3d，將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～5d，即可獲得未知菌的單菌落。放線菌細黃鏈霉菌表4—2 未知菌菌落的形態(tài)菌落號濕干菌落描述判斷結(jié)果厚薄大小松密大小表面邊緣隆起形狀顏色正面反面水溶性色素透明度121一、實驗目的和內(nèi)容目的：復習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。轉(zhuǎn)動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。重復觀察時可比第一次少加香柏油。3．使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。；。 香柏油、二甲苯、無菌水； 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管。如菌液過多，可用吸水紙適當吸去一部分。實驗7 細菌單染色法及口腔微生物的觀察3．固定 手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2～3次。(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然后推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。七、問題和思考1．涂片在染色前為什么要先進行固定?固定時應注意什么問題?2．制備染色裝片時應注意哪些事項，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察?3．你知道口腔中通常存在哪些微生物嗎?如何進行區(qū)分?涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。4．復染 滴加石炭酸復紅液復染lmin，水洗。五、實驗報吉(一)繪圖1．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。一、實驗目的和內(nèi)容目的：了解細菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；學習觀察細菌運動的方法。2．制片 在干凈載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用無菌操作法，以接種環(huán)從活化菌種中取少許菌苔(注意不要帶培養(yǎng)基)，在載玻片的水滴中輕沾幾下。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。(2)在蓋玻片中央滴一小滴菌液（圖9—1A）(3)將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對準蓋玻片中央的菌液(圖91B)，輕輕地蓋在蓋玻片上，便凹玻片與蓋玻片粘在一起(注意液滴不得與凹玻片接觸)。有些細菌，溫度太低時不能運動。 2．細菌的莢膜染色。(5)%沙黃水溶液(%堿性復紅)復染lmin，水洗。(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。三、操作步驟(一)觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細觀察。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插人深度約占蓋玻片1/2長度(圖111A)。接種平板倒置于28℃，培養(yǎng) 5～7d。二、實驗材料和用具釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。2．酵母菌液泡系的話體觀察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。(4)計算子囊形成的百分率：計數(shù)時隨機取3個視野，分別計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細胞，然后按下列公式計算：四、注意事項1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤。注：酵母菌的簡易培養(yǎng) 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調(diào)至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，聞到酒香味后，即可取培養(yǎng)液鏡檢。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油。5．倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。2．粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標本觀察結(jié)果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無假根、足細胞匍匐菌絲、囊軸等）實驗14 細菌大小的測定鏡臺測微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個小格，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。20=。2．標定目鏡測微尺時要注意準確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。設五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000AB（個）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。2．掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。2．標定及測量方法示范。4．菌體大小的測定 將鏡臺測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。內(nèi)容：1. 認識測微尺，學習目鏡測微尺的標定。3．假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。(二)黑根霉假根的培養(yǎng)將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。實驗13 霉菌的形態(tài)觀察3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。3個視野中（形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細胞總數(shù)）100%3．酵母菌細胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。三、操作步驟(一)酵母菌形態(tài)觀察1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。實驗12 酵母菌的形態(tài)觀察將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d。2．玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，3．不同觀察方法中嚴格按要求進行，注意菌體的上下位置。觀察棘孢小單孢菌時注意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細發(fā)亮，其單個分生孢子發(fā)暗，直接生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。芽孢綠色，菌體紅色。芽孢呈綠色，菌體紅色。二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、%沙黃水溶液(%堿性復紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾后備用)、95%乙醇、石炭酸復紅染液；顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。2．試描述你所觀察的細菌有無運動性，是如何運動的?六、問題和思考1．鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?2．根據(jù)你的實驗體會，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?3．試設計一實驗，如何鑒別某種細菌是否能運動，是否有鞭毛，其鞭毛的著生位置。再用火柴棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。(二)細菌運動的觀察1．壓滴法(1)制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。3．染色(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。2．用壓滴法