【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2345678注：四大類微生物菌落的識(shí)別要點(diǎn)如下： 菌落濕潤(rùn)：正反面顏色一致小大而扁平…………小而扁平…… 細(xì)菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌干燥，正反面，中央與邊緣顏色不一致 小 小而致密大大而致密……霉菌大而疏松……實(shí)驗(yàn)5 顯微鏡油浸系物鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。內(nèi)容：1．學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。 2．用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色裝片。香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟(一)觀察前的準(zhǔn)備1．將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約為4cm。坐正，練習(xí)用左眼觀察。2．調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺(tái)相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對(duì)光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時(shí)，光線宜強(qiáng)；觀察末染色裝片時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡(jiǎn)，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(四)油鏡觀察1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。2．從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。4．再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。(五)鏡檢完畢后的工作1．移開物鏡鏡頭。2．取出裝片。3．清潔油鏡，油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。將接物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對(duì)聚光器，同時(shí)降下聚光器，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。四、注意事項(xiàng)1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察2．下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過(guò)多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4．注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。六、問題和思考1．用油鏡便于觀察細(xì)菌的依據(jù)是什么？2．使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題？3．當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？油鏡的基本原理（一）油鏡頭的辨認(rèn)油鏡頭上?？逃蠴I(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標(biāo)記，在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numerical aperture）最大，而工作距離最短（圖5—1）圖5—1 顯微鏡物鏡參數(shù)示意圖（二）顯微鏡的分辨率顯微鏡性能的優(yōu)劣不單是看它的總放大倍數(shù)，更重要的是看它分辯率的大小。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長(zhǎng)（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。從上式可看出，縮短光波長(zhǎng)和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積； 影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣（n= ）的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減少鏡口角（圖5—2A）。當(dāng)以香柏油（n=）為介質(zhì)時(shí)，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過(guò)載玻片后可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射（圖5—2B），不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過(guò)增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的。，；。圖5—2 介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時(shí)光線通過(guò)的比較實(shí)驗(yàn)6 細(xì)菌形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固油鏡的使用；掌握細(xì)菌形態(tài)觀察的基本方法，了解細(xì)菌的基本形態(tài)。內(nèi)容：1．觀察細(xì)菌的基本形態(tài)染色裝片。2．觀察枯草芽孢桿菌活菌。3．觀察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色裝片。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具溶血鏈球菌(Streptococcus haemolyticus )、棒桿菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis )、普通變形菌(Proteus vulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridum acetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum )等細(xì)菌的染色裝片，枯草芽泡桿菌(Bacillus subis)的斜面菌種。 香柏油、二甲苯、無(wú)菌水； 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管。三、操作步驟 (一)觀察細(xì)菌的基本形態(tài)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察溶血鏈球菌、棒桿菌、螺菌、浮游球衣菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。 (二)觀察細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察巨大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)、巨大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。(三)觀察枯草桿菌活菌，常用壓滴法觀察。 1．將潔凈無(wú)油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無(wú)菌水。2．將酒精燈放于自己正前方，點(diǎn)燃。3．用無(wú)菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。4．用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過(guò)多，可用吸水紙適當(dāng)吸去一部分。5．先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察，觀察時(shí)光線要適當(dāng)調(diào)暗些。四、注意事項(xiàng)1．注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙。2，觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片，放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作，不能在油鏡下直接取下和替換裝片，切記！3．無(wú)菌操作過(guò)程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過(guò)多。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖l．給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖。2．給出你所觀察到的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)視野圖，并注明各部分。(二)試指出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問題?七、問題和思考1．用明視野顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?2．無(wú)菌操作過(guò)程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?3試設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)的工作方案。實(shí)驗(yàn)7 細(xì)菌單染色法及口腔微生物的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固無(wú)菌操作技術(shù)，掌握細(xì)菌的涂片和單染色技術(shù)，了解口腔中的微生物及其觀察方法。內(nèi)容：。2. 用單染色法或負(fù)染色法觀察口腔中的微生物。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌種。呂氏美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、無(wú)菌牙簽。三、操作步驟(一)單染色法1．涂片 在潔凈無(wú)脂的載玻片中央滴一小滴無(wú)菌水，用無(wú)菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～(圖7—1A、B)。2．干燥 將涂片于室溫中自然干燥。3．固定 手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過(guò)微火2～3次。在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞(圖7—1C)。4．染色 將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min（圖7—1D）5．水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來(lái)水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無(wú)染色液的顏色為止（圖7—1E）。6．干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。7．待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。圖7—1 單染色的方法 (二)口腔微生物的觀察1．單染色法(1)在潔凈無(wú)油膩的載片中央滴一小滴無(wú)菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，涂成薄膜。(2)將涂片于室溫中自然干燥后，按上面單染色法的步驟，進(jìn)行固定、染色、水洗，干燥后鏡檢。2．負(fù)染色法(1)在潔凈無(wú)油膩的載片的一端滴一小滴無(wú)菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，然后加少許黑色素溶液，充分混勻。(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然后推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。(3)于室溫中自然干燥。(4)鏡檢：將光線調(diào)亮，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。四、注意事項(xiàng)載玻片要潔凈無(wú)脂，否則菌液涂不開。涂片時(shí)，滴水不要過(guò)多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．單染色后觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖。2．你所觀察到的口腔微生物的形態(tài)圖，并注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。(二)單染色法和負(fù)染色法操作要點(diǎn)。七、問題和思考1．涂片在染色前為什么要先進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么問題?2．制備染色裝片時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察?3．你知道口腔中通常存在哪些微生物嗎?如何進(jìn)行區(qū)分?實(shí)驗(yàn)8 細(xì)菌的革蘭氏染色目的：初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。內(nèi)容：1．制作細(xì)菌染色裝片。 2．進(jìn)行革蘭氏染色法操作。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具蘇云金桿菌或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌()菌液，待測(cè)菌菌液1～2種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。三、操作步驟(一)制片1．涂菌 用無(wú)菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無(wú)脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2．干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過(guò)高)。3．固定 目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過(guò)火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色l．初染 于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。2．媒染 滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。3．脫色 滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗。4．復(fù)染 滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。5．濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。(四)檢測(cè)未知菌用以上方法對(duì)未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。