【正文】 棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)，后者只是在原處左右擺動(dòng)，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才能判定為有運(yùn)動(dòng)性。(二)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的觀察1．壓滴法(1)制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。(5)待冷卻后，用蒸餾水輕輕沖洗干凈，自然干燥或?yàn)V紙吸干。3．染色(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。三、操作步驟(一)細(xì)菌鞭毛染色1．活化菌種 將保存的變形菌在新制備的普通牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上連續(xù)移種2～3次，每次于30℃培養(yǎng)10～15h。2．用壓滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。(二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。3．脫色時(shí)間十分重要，過長，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽性菌。(三)結(jié)果革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。2．媒染 滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。目的：初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。2．你所觀察到的口腔微生物的形態(tài)圖，并注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。(4)鏡檢：將光線調(diào)亮，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。(2)將涂片于室溫中自然干燥后，按上面單染色法的步驟，進(jìn)行固定、染色、水洗，干燥后鏡檢。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞(圖7—1C)。三、操作步驟(一)單染色法1．涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～(圖7—1A、B)。內(nèi)容：。(二)試指出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問題?七、問題和思考1．用明視野顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?2．無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?3試設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)的工作方案。四、注意事項(xiàng)1．注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙。3．用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。 (二)觀察細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察巨大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)、巨大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。3．觀察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色裝片。實(shí)驗(yàn)6 細(xì)菌形態(tài)的觀察當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣（n= ）的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減少鏡口角（圖5—2A）。從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間最小距離（D）的能力。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。2．取出裝片。仔細(xì)觀察并繪圖。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。坐正，練習(xí)用左眼觀察。 2．用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。73霉菌產(chǎn)黃青霉粘紅酵母七、問題和思考1．試比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌菌落形態(tài)的差異?2．設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室空氣環(huán)境中的微生物類別?表4—1 已知菌菌落的形態(tài)微類生物數(shù)菌名辯別要點(diǎn)菌落描述濕干表面邊緣隆起形狀顏色透明度厚薄大小松密大小正面反面 水溶性色素細(xì)菌大腸桿菌(三)直接觀察菌落直接用實(shí)驗(yàn)3中的“土壤稀釋分離”獲得的單菌落進(jìn)行觀察識(shí)別，并將結(jié)果填入表42中。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，酵母菌于28℃培養(yǎng)2～3d，霉菌和放線菌置28℃培養(yǎng)5～7d，待長成菌落后，仔細(xì)觀察四大類微生物菌落的形態(tài)特征，并將觀察結(jié)果記錄于表41中。三、操作步驟(一)制備已知菌的單菌落1．制備平板 將已融化的無菌培養(yǎng)基待冷卻至50℃左右，分別制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板和高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板各一皿。2．根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。七、問題和思考1．在測(cè)定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?2．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。3．放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。（三）斜面接種和穿刺接種1．斜面接種（1）取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標(biāo)記（寫上菌名、接種日期、接種人等），然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面上。圖3—3 平板劃線方法示意圖A. 劃線分離操作。2．劃線分離 使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落，主要方法參見圖3—3。4．培養(yǎng) 將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28～30℃中恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)1～2d，放線菌培養(yǎng)5～7d，霉菌培養(yǎng)3～5d。(2)稀釋：，如此重復(fù)，可依次制成103～108的稀釋液(圖31)。已滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶，(帶玻璃珠)1瓶，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。內(nèi)容：l．用稀釋法分離細(xì)菌、放線菌和霉菌。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告 l．結(jié)果記錄無菌檢查結(jié)果2．思考題(1)你做的過濾除菌實(shí)驗(yàn)效果如何?如果經(jīng)培養(yǎng)檢查有雜菌生長，你認(rèn)為是什么原因造成的?(2)如果你需要配制一種含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其抗生素的終濃度(或工作濃度)為50μg/ml，你將如何操作?(3)過濾除菌應(yīng)注意哪些問題? 3．壓濾將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭撥出。2．儀器或其他用具 注射器，微孔濾膜過濾器，無菌試管，鑷子，玻璃刮棒。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。（1）細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)菌芽孢對(duì)紫外線和的抵抗力會(huì)一樣嗎，為什么？（2）你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通燈用玻璃？（3）在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，為什么要隔一塊普通玻璃？四 微孔濾膜過濾除菌（一）目的要求1．了解過濾除菌的原理。2%～3%來蘇爾+紫外線照射 （3）檢查滅菌效果[方法同“單用紫外線照射”(3)]。 （3）檢查每個(gè)平板上生長的菌落數(shù)。（四）操作步驟l．單用紫外線照射（1）在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關(guān)，照射30min，將開關(guān)關(guān)閉。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。 2．思考題（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，怎樣杜絕一切不安全的因素?（3）滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義?（4）黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對(duì)熱的抗性哪個(gè)最強(qiáng)?為什么? 三、紫外線滅菌（一）目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法（二）基本原理紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。壓力一定要降到“0”時(shí)，才能打開排氣閥，開蓋取物。℃，20min滅菌。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。2．放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。 7. 篩架。 。 ,℃滅菌20min即可，122℃滅菌30min。表22 干熱溫?zé)岽┩噶皽缇Ч容^溫度/℃時(shí)間/h透過布層的溫度/℃滅菌20層10層100層干熱13014048672不完全3101101101完全1g水在100℃時(shí)，(千焦)的熱量。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題l．在干熱滅菌操作過程中應(yīng)注意哪些問題，為什么?2．為什么干熱火菌比濕熱滅菌所需要的溫度要高，時(shí)間要長?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較實(shí)驗(yàn)方案。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。當(dāng)溫度升至100℃時(shí)，關(guān)閉排氣孔。 （三）器材培養(yǎng)皿、試管、吸管、電烘箱等。 。 。 。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時(shí)間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。一、干熱滅菌（一）目的要求1．了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。六、問題和思考l．配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查? 3．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無菌檢查。四、注意事項(xiàng) 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO4待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。再加入其他成分依次溶解。3H2O ，MgSO49．?dāng)[斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。若偏堿，則用lmol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNONaCl、K2HPO4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)黃文芳　張　松　編著 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)1 培養(yǎng)基的配制3．馬丁氏培養(yǎng)基的配制。7H2O。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。3． 調(diào)pH 檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。4．過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。7．包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl ，K2HPO4 l．稱量和溶解 先計(jì)算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。7H2O，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于20℃)，在100mL培養(yǎng)基中加1% ，使每毫升培養(yǎng)基中合鏈霉素30μg。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)2 消毒與滅菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。 。 。 。 14. 散熱板。2．