【正文】 B（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/516104B=32000A目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。一 顯微鏡直接計數(shù)法（一）目的要求1．明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。試與己知的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的大小作一比較是否一致？為何？七、問題和思考1．為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時必須重新用鏡臺測微尺對目鏡微尺進行標定？2．若目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測微尺每格所測量的鏡臺上的菌體細胞的實際長度（或?qū)挾龋┦欠裣嗤?？為什么?4五、演示1．目鏡測微尺、鏡臺測微尺的顯微鏡下示教。用以上計算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。2．目鏡測微尺的標定 把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)會測微尺的使用和計算方法及對球菌和桿菌的測量。鏡檢。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養(yǎng)3～5d。透明膠帶、剪刀、培養(yǎng)皿、載玻片、口形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)。2．在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率。子囊形成率（%）=3個視野中形成子囊的總數(shù)247。細胞無色，液泡呈紅色。PDA培養(yǎng)基、麥氏(McCLary)培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基)、%美藍染色液()、碘液、%的中性紅染色液%孔雀綠，%沙黃液、95%乙醇；顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個三角形玻璃棒支架的培養(yǎng)皿。同時，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5406菌孢子至蓋玻片一側(cè)的基部，且僅接種于其中央位置約占蓋玻片長度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側(cè)。四、注意事項1．培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應(yīng)特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染。注意區(qū)分5406菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。(二)試制片，但不進行染色，觀察是否能看到芽孢和莢膜?七、問題和思考1．為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?2．組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?3．試設(shè)計實驗如何鑒定某一產(chǎn)芽孢菌株的芽孢形態(tài)、著生位置及所屬分類地位。2．背景染色(1)先加1滴墨水于潔凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(7)干燥后用油鏡觀察。(6)制片干燥后用油鏡觀察。二、實驗材料和用具枯草芽孢桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。五、實驗報告1．繪出你所觀察到的細菌的形態(tài)及鞭毛著生情況。(4)小心將玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌液正好懸在窩的中央。注意觀察鞭毛著生位置(鏡檢時應(yīng)多找?guī)讉€視野，有時只在部分涂片上染出鞭毛)。將載玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩流到另一端，然后平放，于空氣中干燥。內(nèi)容：1. 細菌的鞭毛染色法。2．金黃色葡萄球菌或蘇云金桿菌革蘭氏染色視野圖。5．濾紙吸干，油鏡鏡檢。2．干燥 于空氣中自然干燥。實驗8 細菌的革蘭氏染色(3)于室溫中自然干燥。在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固無菌操作技術(shù)，掌握細菌的涂片和單染色技術(shù)，了解口腔中的微生物及其觀察方法。5．先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察，觀察時光線要適當(dāng)調(diào)暗些。三、操作步驟 (一)觀察細菌的基本形態(tài)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察溶血鏈球菌、棒桿菌、螺菌、浮游球衣菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。圖5—2 介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時光線通過的比較4．注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。(五)鏡檢完畢后的工作1．移開物鏡鏡頭。(四)油鏡觀察1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察末染色裝片時，光線不宜太強。內(nèi)容：1．學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。注：四大類微生物菌落的識別要點如下：6黑曲霉金黃色葡萄球菌4．編號 從培養(yǎng)好的未知平板中，挑選8個不同的單菌落，逐個編號，根據(jù)菌落識別要點區(qū)分未知菌落類群，并將判斷結(jié)果填入表4～2中。接種環(huán)、接種針、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿多套、電熱恒溫箱。3．比較兩種細菌穿刺接種的結(jié)果，并進行分析。2．穿刺接種（1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基，做好標記（寫上菌名）、接種日期，接種人等）。3．培養(yǎng) 方法同“土壤稀釋分離”。1．倒平板 按無菌操作要求，在火焰旁操作（圖3—2），做法如3（1）。倒平板時要注意無菌操作，見圖32。二、實驗材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜面菌種。整個過程應(yīng)在無菌條件下嚴格無菌操作，以防污染，過濾時應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象。（三）器材1．培養(yǎng)基 2%的葡萄糖溶液，肉湯蛋白胨平板。2．思考題。 （2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%～3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。3．儀器或其他用具 紫外線燈。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。5．滅菌所需時間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。3．加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。 。圖2—2A 臥式滅菌鍋（8Ib/）℃滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表2—1），二是濕熱的穿透力比干熱大（表2—2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。電烘箱內(nèi)溫度末降到70℃，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。2．升溫接通電源，撥動開關(guān)，打開電烘箱排氣孔，旋動恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮，讓溫度逐漸上升。 。 。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。五、實驗報告記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點。待各成分完全溶解后，補充水分到所需體積。7H2O，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl ，K2HPO47．包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。3． 調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。7H2O。實驗1 培養(yǎng)基的配制微生物學(xué)實驗指導(dǎo)黃文芳　張　松　編著 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二、實驗材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNONaCl、K2HPO4蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。9．?dāng)[斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。再加入其他成分依次溶解。其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO4四、注意事項 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時蓋緊瓶蓋。一、干熱滅菌（一）目的要求1．了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。 。 （三）器材培養(yǎng)皿、試管、吸管、電烘箱等。嚴防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。表22 干熱溫?zé)岽┩噶皽缇Ч容^溫度/℃時間/h透過布層的溫度/℃滅菌20層10層100層干熱13014048672不完全3101101101完全 。2．放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。℃，20min滅菌。 2．思考題（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素?（3）滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義?（4）黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對熱的抗性哪個最強?為什么? 三、紫外線滅菌（一）目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法（二）基本原理紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。 （3）檢查每個平板上生長的菌落數(shù)。2%～3%來蘇爾+紫外線照射微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。3．壓濾將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭撥出。內(nèi)容：l．用稀釋法分離細菌、放線菌和霉菌。(2)稀釋：，如此重復(fù)，可依次制成103～108的稀釋液(圖31)。4．培養(yǎng) 將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28～30℃中恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)1～2d，放線菌培養(yǎng)5～7d，霉菌培養(yǎng)3～5d。圖3—3 平板劃線方法示意圖A. 劃線分離操作。3．放線菌的培養(yǎng)時間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。2．根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。細菌于37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，酵母菌于28℃培養(yǎng)2～3d，霉菌和放線菌置28℃培養(yǎng)5～7d，待長成菌落后，仔細觀察四大類微生物菌落的形態(tài)特征，并將觀察結(jié)果記錄于表41中。七、問題和思考1．試比較細菌、放線菌、酵母菌和霉菌菌落形態(tài)的差異?2．設(shè)計一個實驗，檢測實驗室空氣環(huán)境中的微生物類別?表4—1 已知菌菌落的形態(tài)微類生物數(shù)菌名辯別要點菌落描述濕干表面邊緣隆起形狀顏色透明度厚薄大小松密大小正面反面 水溶性色素細菌大腸桿菌霉菌產(chǎn)黃青霉7坐正，練習(xí)用左眼觀察。用細調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。仔細觀察并繪圖。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（n= ）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角（圖5—2A）。3．觀察細菌細胞結(jié)構(gòu)的染色裝片。3．用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。(二)試指出在制備活菌裝片時，應(yīng)注意什么問題?七、問題和思考1．用明視野顯微鏡觀察細菌的形態(tài)時，你認為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?2．無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?3試設(shè)計一個準備本實驗的工作方案。三、操作步驟(一)單染色法1．涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～(圖7—1A、B)。(2)將涂片于室溫中自然干燥后，按上面單染色法的步驟，進行固定、染色、水洗，干燥后鏡檢。2．你所觀察到的口腔微生物的形態(tài)圖，并注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。2．媒染 滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。3．脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。三、操作步驟(一)細菌鞭毛染色1．活化菌種 將保存的變形菌在新制備的普通牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上連續(xù)移種2～3次，每次于30℃培養(yǎng)10～15h。(5)待冷卻后，用蒸餾水輕輕沖洗干凈，自然干燥或濾紙吸干。要區(qū)分細菌鞭毛運動和布朗運動，后者只是在原處左右擺動，細菌細胞間有明顯位移者，才能判定為有運動性。染色時一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：掌握細菌的芽孢及莢膜染色方法。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火