【正文】 —4A）。（3）接種后30℃恒溫培養(yǎng)， 24h后觀察，比較兩種菌的生長結(jié)果。實(shí)驗(yàn)4 微生物菌落的觀察2．制備菌懸液或孢子懸液 在培養(yǎng)好的斜面菌種管內(nèi)加入5mL無菌水，制成菌懸液后備用。四、注意事項(xiàng)觀察菌落特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開的單個(gè)較大菌落；已知菌落和未知菌落要編好號(hào)，請(qǐng)勿隨意移動(dòng)開蓋，以免搞混菌號(hào)?；疑溍咕? 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色裝片。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。2．從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3．清潔油鏡，油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。六、問題和思考1．用油鏡便于觀察細(xì)菌的依據(jù)是什么？2．使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題？3．當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？油鏡的基本原理（一）油鏡頭的辨認(rèn)油鏡頭上?？逃蠴I(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標(biāo)記，在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numerical aperture）最大，而工作距離最短（圖5—1）數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積；一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固油鏡的使用；掌握細(xì)菌形態(tài)觀察的基本方法，了解細(xì)菌的基本形態(tài)。(三)觀察枯草桿菌活菌，常用壓滴法觀察。2，觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片，放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作，不能在油鏡下直接取下和替換裝片，切記！3．無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。2. 用單染色法或負(fù)染色法觀察口腔中的微生物。4．染色 將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min（圖7—1D）5．水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止（圖7—1E）。四、注意事項(xiàng)載玻片要潔凈無脂，否則菌液涂不開。內(nèi)容：1．制作細(xì)菌染色裝片。3．固定 目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。(四)檢測(cè)未知菌用以上方法對(duì)未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。(三)未知菌的檢測(cè)結(jié)果。3．用懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。(2)用蒸餾水充分洗凈A液，使背景清潔。(2)取2～3環(huán)稀釋菌液于潔凈載玻片中央，%的美藍(lán)水溶液，混勻。（5）鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到懸滴的邊緣后(圖9—1D)，再將菌液移至視野中央，換用高倍鏡觀察，注意細(xì)菌是如何運(yùn)動(dòng)的，它與分子布朗運(yùn)動(dòng)的不同。三、操作步驟(一)芽孢染色法1．方法1(1)取37℃培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見“細(xì)胞單染色法”)。2．方法2(1)加1～2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分混勻打散，制成濃稠的菌液。(二)莢膜染色法1．石炭酸復(fù)紅染色（1）取培養(yǎng)了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。(3)干燥后用油鏡觀察。實(shí)驗(yàn)11 放線菌的形態(tài)觀察注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差異。繪圖。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪圖 玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長狀態(tài)下觀察的放線菌形態(tài)。2．搭片法 (1)開槽及接種：用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個(gè)，并將棘孢小單孢菌孢子劃線接種至洞內(nèi)邊緣。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解自然存在的酵母菌及其形態(tài)結(jié)構(gòu)。(2)%美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個(gè)體形態(tài)，區(qū)分其母細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。4．酵母菌子囊孢子的觀察 (1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的麥芽汁培養(yǎng)基上，置28C培養(yǎng)2～3d，然后再移植2～3次。5．酵母菌假菌絲的觀察 取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在溫室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1)，28℃培養(yǎng)2～3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．?dāng)?shù)個(gè)酵母菌細(xì)胞，示觀察到的結(jié)構(gòu)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。1．準(zhǔn)備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12lC濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個(gè)假根間的匍匐菌絲，觀察時(shí)注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。2．測(cè)定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體的大小。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線(圖15—lB)。先量出菌體的長和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長度計(jì)算出菌體的長和寬。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．目鏡測(cè)微尺標(biāo)定結(jié)果：低倍鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長度是 μm。37均值實(shí)驗(yàn)15 微生物數(shù)量的測(cè)定（二） 基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。?jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。總之，測(cè)定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。95m寬長寬長1四、注意事項(xiàng)1．鏡臺(tái)測(cè)微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時(shí)，要格外注意，以免壓碎鏡臺(tái)測(cè)微尺或損壞鏡頭。例如，目鏡測(cè)微尺20個(gè)小格等于鏡臺(tái)測(cè)微尺3小格，已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每格為10μm，則3小格的長度為310=30μm，那么相應(yīng)地在目鏡測(cè)微尺上每小格長度為310247。目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖1．毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。繪圖。4．加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁，否則不透氣。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具產(chǎn)黃青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、總狀毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌種。圖12—1 酵母菌假菌絲的培養(yǎng) 圖12—2 酵母菌的假菌絲形態(tài) A. 藕節(jié)狀假菌絲； 6．自然狀態(tài)下的酵母菌觀察 取一滴美藍(lán)染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細(xì)觀察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。注意觀察子囊孢子的數(shù)目、形狀和子囊的形成率。死活細(xì)胞總數(shù)100%3．觀察自然狀態(tài)的酵母菌。3．涂布菌液及培養(yǎng) mL的孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養(yǎng)基表面。(2)插片及培養(yǎng)：用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已接種平板上以45176。繪圖。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響觀察。%美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液；蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。(5)干燥后用油鏡觀察。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。內(nèi)容：1．細(xì)菌的芽泡染色。2．觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則會(huì)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。2．懸滴法(1)取潔凈蓋玻片，在四周涂少許凡士林。 4．鏡檢 先用低倍鏡和高倍鏡找到典型區(qū)域，然后用油鏡觀察。活化后菌種備用。實(shí)驗(yàn)9 細(xì)菌鞭毛染色及其運(yùn)動(dòng)的觀察4．老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。3．脫色 滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗。三、操作步驟(一)制片1．涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。(二)單染色法和負(fù)染色法操作要點(diǎn)。2．負(fù)染色法(1)在潔凈無油膩的載片的一端滴一小滴無菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，然后加少許黑色素溶液，充分混勻。2．干燥 將涂片于室溫中自然干燥。4．用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具溶血鏈球菌(Streptococcus haemolyticus )、棒桿菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis )、普通變形菌(Proteus vulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridum acetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum )等細(xì)菌的染色裝片，枯草芽泡桿菌(Bacillus subis)的斜面菌種。當(dāng)以香柏油（n=）為介質(zhì)時(shí)，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射（圖5—2B），不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的。D值愈小表明分辨率愈高。四、注意事項(xiàng)1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察2．下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。4．再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。2．調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺(tái)相距約1mm左右。實(shí)驗(yàn)5 顯微鏡油浸系物鏡的使用4酵母菌釀酒酵母(二)制備未知菌落l．倒平板2．接種 可用彈土法接種，其要點(diǎn)為：采集校園土壤，待風(fēng)干磨碎后，可將細(xì)土撒在無菌的硬板紙表面，先彈去紙面浮土，然后打開皿蓋，便含土的紙面對(duì)著平板培養(yǎng)基的表面，用手指在硬板紙背面輕輕一彈即可接種上各種微生物。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘紅酵母(Rhodotorula gracitis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、細(xì)黃鏈霉菌(Streptomyces microflavus，又稱“5406”抗生菌)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus )、黑曲霉(Aspergillus niger )、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveria bassiana)等細(xì)菌的斜面菌種。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．記錄土壤稀釋分離結(jié)果，并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌、放線菌和霉菌的數(shù)量。 , 可連接劃線。觀察生長的菌落，用于進(jìn)一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。圖3—1 稀釋法分離土壤微生物操作過程圖解3. 混菌法測(cè)定菌落數(shù)的方法(1)細(xì)菌：取10106兩管稀釋液各1mL，分別接人相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。]注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。2．用平