【正文】 此，具有還原能力的酵母細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。酵母菌是不運動的單細(xì)胞真核微生物，通常比常見細(xì)胞大幾倍甚至十幾倍。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。簡稱“氣絲”) 3. 曲霉、青霉、根霉形態(tài)觀察。2. 了解酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)。 8．注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。 3．脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，陰涼干燥處存放。 5. 鏡撿完畢后的工作 （1）移開物鏡鏡頭。仔細(xì)觀察并繪圖。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位（鏡頭的正下方）滴一滴香柏油。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。 2. 低倍鏡觀察染色裝片 首先上升鏡筒，將細(xì)菌染色裝片置于載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方， cm處，適當(dāng)縮小光圈，然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升（或使鏡臺下降）至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。 （二）鏡檢1. 觀察前的準(zhǔn)備 （1）將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4 cm。 （2）媒染 滴加盧戈氏碘液，1 min后水洗。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥（溫度不宜過高）。3. 儀器及用具顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。 圖11 顯微鏡物鏡參數(shù)圖顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。二、 實驗原理（一） 油鏡的基本原理 普通光學(xué)顯微鏡包括低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡。2. 初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟（二）實驗內(nèi)容1．學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。 2．制作細(xì)菌染色裝片。油鏡是一種高倍放大的物鏡，一般都刻有放大倍數(shù)，如9100等。D值愈小表明分辨率愈高。 當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（n＝）與玻璃（n＝）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。 四、操作步驟(一) 細(xì)菌的革蘭氏染色1. 制片 （1）涂菌 用無菌操作方法從平板中沾取菌苔一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1 cm的菌膜。 （3）固定 將細(xì)菌涂片向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。 （3）脫色 滴加95％乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30 s 至1 min)，立即水洗。坐正。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。將最適宜觀察部分移至視野中心，繪圖。 （2）從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。 （4）再次觀察，提起鏡筒，換上另一塊細(xì)菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察。 （2）取出裝片。 (三) 結(jié)果 革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色, 革蘭氏陰性菌染成淡紅色。 4．老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。 六、實驗報告1. 分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。3. 了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。 二、實驗原理放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的革蘭氏陽性細(xì)菌，常見放線菌大多能形成菌絲體。并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。在油鏡下觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱狀。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。霉菌可產(chǎn)生分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察；此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。 透明膠帶、剪刀、圓形濾紙片、細(xì)口滴管、鑷子。(二) 酵母菌的形態(tài)觀察1．酵母菌的活體染色觀察及死亡率的測定 (1) 以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。細(xì)胞無色，液泡呈紅色?？蓮呐囵B(yǎng)1620 h開始，連續(xù)觀察，了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。鏡檢。 2．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細(xì)胞。 七、問題和思考l．用插片法和搭片法如何制備放線菌標(biāo)本，其主要優(yōu)點是什么?可否用此法觀察其他微生物?為什么?2．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?3. 什么叫載玻片濕室培養(yǎng)? 它適用于觀察怎樣的微小物，有何優(yōu)點?附錄: (—) 插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1．插片法(圖23A) (1) 制平板、接種用冷卻至約50℃的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基倒平板（每皿約20 mL）。 同時，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5406菌孢子至蓋玻片一側(cè)的基部，但僅接種于其中央位置約占蓋玻片寬度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側(cè)，將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)37d。 （2）取菌接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。 （5）倒保濕劑 每皿倒入約3 mL 20％的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤滑，以保持皿內(nèi)濕度。 圖24 根霉假根的培養(yǎng)實驗三 培養(yǎng)基的配制、消毒和滅菌一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容（一）實驗?zāi)康?. 明確配制培養(yǎng)基的原理，了解消毒和滅菌的原理。 2．高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、過濾除菌法。%的瓊脂配制為半固體培養(yǎng)基，加入12%的瓊脂配制為固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基或其他液體的滅菌一般是用高壓蒸汽滅菌法（又稱濕熱滅菌）。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。3H2O、MgSO4四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。2．滅菌前玻璃器皿和塑料管的包裝培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。其配方如下: 牛肉膏3 g，蛋白胨l0 g， NaCl 5 g，瓊脂13 g, 水1000 mL。 （2）加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。 （6）