【正文】 鹽、生長因子及水分等。培養(yǎng)用的玻璃器皿通常采用干熱滅菌法。7H2O、1%鏈霉素溶液。包裝后的培養(yǎng)皿和塑料管須經滅菌之后才能使用。 （3）調pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1 mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。分裝入三角瓶內以不超過其容積內一半為宜。 若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應先把試管扎成捆后，再于棉塞外包—層牛皮紙。3H2O g，MgSO4待所有藥品完全溶解后．補充水分到所需的總體積。然后加入瓊脂13 g，加熱使瓊脂完全融化，同時補足應有的水量。 （3）加蓋 將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內層滅菌桶的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時旋緊相對的兩個螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開排氣閥。 （1）裝入待滅菌物品 預先將各種器皿用紙包好或裝入金屬制的培養(yǎng)皿筒、移液管筒內，然后放入電熱烘箱中。m、 181。 玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過濾漏斗，其過濾部分是由細玻璃粉燒結成的板狀構造。為加快過濾速度, 一般用負壓抽氣過濾．即在自來水龍頭上裝一抽氣裝置，利用自來水流造成負壓。6．過濾除菌時應注意檢查過濾裝置各連接處是否漏氣，以防污染。 2．用平板劃線法分離微生物。 2. 培養(yǎng)基巳滅菌的牛肉膏、高氏1號、PDA固體培養(yǎng)基各1瓶。 圖42 倒平板的方法 圖43 平板涂布菌（2）接種量和培養(yǎng)基 細菌：取10107兩管稀釋液各1 mL，分別接入相應標號的平皿中，每個稀釋度接入兩個牛肉膏瓊脂平板中，涂布均勻。(3) 接種后30℃恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)48 h，放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存。計算方法：選擇長出菌落數30300之間的培養(yǎng)皿進行計數, 按以下公式： 總菌數/g＝同一稀釋度幾次重復的菌落平均數稀釋倍數 七、問題和思考1．在測定土壤微生物含量中，除涂布法外還用什么方法? 2．試設計實驗，從茶葉中分離出霉菌。 （3）培養(yǎng)發(fā)酵 發(fā)酵2 d 便可聞到酒香味，開始滲出清液，34 d 滲出液越來越多，此時，把洞填平，讓其繼續(xù)發(fā)酵。四、注意事項（1）釀制糯米甜酒時糯米飯一定要煮熟煮透，不能太硬或夾生；米飯一定要涼適至35℃拌酒曲，否則會影響正常發(fā)酵。（4）放置2周后，可將葡萄皮撈起，并過濾。加熱蒸熟成飯，即為甜酒培養(yǎng)基。 3．放線菌的培養(yǎng)時間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當增多。 （三）斜面接種和穿刺接種 1．斜面接種 (1) 取新鮮固體斜面培養(yǎng)基．分別做好標記(寫上菌名、接種日期、接種人等)，然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面中。注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以減少稀釋中的誤差。單菌落是由一個細胞繁殖而成的集合體，即是一個純培養(yǎng)。2. 掌握常用的分離純化微生物的操作技術。4. 使用滅菌鍋應嚴格按照操作程序進行，避免發(fā)生事故；滅菌時，操作者切勿擅自離開，待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋。在抽洗液中加入數滴BaCl2扎，至不出現BaSO4沉淀時，即表示巳洗凈。溶液中的細菌通過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對溶液中其他物質的吸附性也大。 （1）過濾器的種類 濾膜過濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格( 181。 （8）無菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h，無雜菌生長，即可待用。 （1）加水 將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，以水面與三角架相平為宜 （2）裝料 將裝料桶放回鍋內，裝入待滅菌的物品。 用雙層潔凈紗布過濾去渣，在濾液中加葡萄糖（或蔗糖）20 g，加水補足1000 mL。7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100 mL水中加入1 g的FeSO4 2．高氏1號培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。有時也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。 （2）加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。2．滅菌前玻璃器皿和塑料管的包裝培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。3H2O、MgSO4培養(yǎng)基或其他液體的滅菌一般是用高壓蒸汽滅菌法（又稱濕熱滅菌）。 2．高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、過濾除菌法。 （5）倒保濕劑 每皿倒入約3 mL 20％的無菌甘油，使皿內的濾紙完全潤滑，以保持皿內濕度。 同時，在另一半未經接種的部位以同樣方式插入數塊蓋玻片，然后接種少量5406菌孢子至蓋玻片一側的基部，但僅接種于其中央位置約占蓋玻片寬度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側，將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)37d。 2．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞?？蓮呐囵B(yǎng)1620 h開始，連續(xù)觀察，了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。(二) 酵母菌的形態(tài)觀察1．酵母菌的活體染色觀察及死亡率的測定 (1) 以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察；此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進行觀察。大多數酵母菌以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產生子囊孢子。并進一步分化產生孢子絲及孢子。3. 了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。 4．老齡菌因體內核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。 （2）取出裝片。 （2）從側面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。 （3）脫色 滴加95％乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據涂片之厚薄需時30 s 至1 min)，立即水洗。 四、操作步驟(一) 細菌的革蘭氏染色1. 制片 （1）涂菌 用無菌操作方法從平板中沾取菌苔一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1 cm的菌膜。 當鏡與裝片之間的介質為空氣時，由于空氣（n＝）與玻璃（n＝）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。油鏡是一種高倍放大的物鏡，一般都刻有放大倍數，如9100等。2. 初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟（二）實驗內容1．學習油浸系物鏡的使用方法。 圖11 顯微鏡物鏡參數圖顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成、壁厚、類脂質含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥（溫度不宜過高）。 （二）鏡檢