【正文】 20 / 20。[4] 黃秀梨，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，高等教育出版社 ,1999 年。[2] 周德慶，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》第二版，高等教育出版社 ,2002年。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄將雙歧桿菌口服液混菌發(fā)酵液發(fā)酵結(jié)果記錄于下表中。 輔助原料按發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)發(fā)酵液)配方配制，現(xiàn)配現(xiàn)用以防污染；在發(fā)酵及傳代中應(yīng)避免雜菌污染?！?，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁沉淀時(shí)，表明此時(shí)活菌數(shù)很高且大量產(chǎn)酸()，即可終止發(fā)酵。煮汁一定要細(xì)過濾。(4) 挑取少許具有上述菌落特征和菌株，分別接入裝有50ml去脂TJA培養(yǎng)基的試管中，37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁時(shí)停止作發(fā)酵劑用，如果需用量大可改用發(fā)酵罐培養(yǎng)。青春型雙歧桿菌在培養(yǎng)基平板表面常呈現(xiàn)的形態(tài)菌落特征: 大小為23mm, 菌落中央呈隆起狀，邊緣整齊，半透明狀，有濃郁的醋酸味，染色鏡檢為短桿狀。分離后，放37℃下培養(yǎng)以獲得單菌落。(二) 實(shí)驗(yàn)方法菌株活化及發(fā)酵劑制作(1) 倒平板培養(yǎng)基：將改良TJA培養(yǎng)基完全融化并冷卻至45℃左右倒平板，冷凝待用。青春型雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸球菌的發(fā)酵菌種：試管斜面—→轉(zhuǎn)種50 mL試管—→250mL三角瓶—→測(cè)定菌量、酸度和pH值。 發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)發(fā)酵液)：番茄汁1 ml；酵母浸出物1g；乳糖1g；葡萄糖1g；K2HPO4 ；Tween80 ；3%豆粕浸汁100ml。 BL培養(yǎng)基（培養(yǎng)乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白胨15g；酵母浸膏6g；肝浸液45 mL；葡萄糖20g；； NaCl5g；Tween80 3ml；LCys g；蒸餾水1000mL；。三、材料與方法(一) 實(shí)驗(yàn)材料菌種：雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌由本實(shí)驗(yàn)室篩選，經(jīng)權(quán)威部門鑒定符合生產(chǎn)和臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。乳酸桿菌和乳酸球菌產(chǎn)酸快，從而為雙歧桿菌提供較低的pH值環(huán)境，對(duì)它的生長(zhǎng)繁殖有促進(jìn)作用，因此選擇乳酸桿菌和乳酸球菌作輔助發(fā)酵菌株。微好氧菌株經(jīng)過馴化，能承受一定氧壓，既有利于生產(chǎn)，又能促進(jìn)正常菌群生長(zhǎng)和繁殖。二、實(shí)驗(yàn)原理雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸球菌等對(duì)人體有明顯有營養(yǎng)保健作用，是微生態(tài)試劑的重要生產(chǎn)菌株。表 LAS起始濃度對(duì)微生物降解度的影響起始LAS濃度（mg/L）40120180240接種不接種接種不接種接種不接種接種不接種培養(yǎng)后殘留LAS濃度降解度（%）六、思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了什么問題？參考本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一個(gè)污染物微生物降解實(shí)驗(yàn)（要求有污染物的測(cè)定方法）。按下式計(jì)算樣品中LAS濃度。(2)培養(yǎng)液測(cè)定：吸取離心后的培養(yǎng)液上清液110ml，放于250m1分液漏斗中，用蒸餾水稀釋至100ml。以光密度值作縱坐標(biāo)，LAS的毫克數(shù)(所取該液的ml數(shù))作橫坐標(biāo)，制取標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用氯仿將容量瓶中液體稀釋至50 ml刻度處。 ③ 再次提?。杭勇确?ml于上述②分液漏斗的水液中,振蕩分層后將氯仿層并入上述②容量瓶中。② 洗滌：在上述接納了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50ml洗滌液，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層。① 氯仿提?。合蛏鲜龇忠郝┒分屑勇确?0ml，猛烈振蕩30秒鐘，靜置分層，將氯仿層排入另一個(gè)250m1分液漏斗中。(1)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0、120 ml LAS標(biāo)準(zhǔn)液()分別稀釋至100 ml制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液。離心后之上清液留作測(cè)定LAS用。1℃恒溫震蕩培養(yǎng)48小時(shí)。每瓶培養(yǎng)液中接入菌液1ml；每種LAS濃度接2瓶，另設(shè)1瓶不接種作對(duì)照。9．500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脫脂棉等。7．分光光度計(jì)(具波長(zhǎng)652nm)。2H2O ,溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。取此液10ml稀釋至1000ml,。2H2O, 用蒸餾水溶解后加入容量瓶并稀釋至1000ml刻度處。3．美藍(lán)溶液：稱取100 mg美藍(lán)溶于蒸餾水后稀釋至100ml?？筛鶕?jù)所采用的洗滌劑型號(hào)中LAS含量換算，再經(jīng)實(shí)測(cè)（LAS測(cè)定見本實(shí)驗(yàn)“測(cè)定方法”項(xiàng)）。121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。三、器材與用品：氣單胞菌D4(Aeromonas sp．D4，可由中國科學(xué)院水生生物研究所提供)；YM8菌株（由本實(shí)驗(yàn)中心在活性污染中分離）。環(huán)境中表面活性劑的消失幾乎全靠微生物的作用，微生物通過其特殊的酶系的降解能力受到菌株類型、表面活性劑濃度及其他多種物理化學(xué)因素的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理有機(jī)污染物廣泛存在自然環(huán)境中，絕大多數(shù)污染物可以在微生物的作用下被降解，本實(shí)驗(yàn)以表面表面活性劑為模式有機(jī)污泥物進(jìn)行生物降解實(shí)驗(yàn)。 試設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離酵母菌。六、思考題 如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？在平板上你分離得到哪些類群的微生物？簡(jiǎn)述它們的菌落特征。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動(dòng)，以使穿刺線整齊，便于觀察生長(zhǎng)結(jié)果。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。但要注意接種所用水容量要計(jì)算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會(huì)使接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。 固體接種法：普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。如接種霉菌菌種時(shí)，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時(shí)，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。將菌種斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對(duì)齊，應(yīng)斜持試管呈45～50度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個(gè)菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。 同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。平板劃線分離法 觀察并挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。 室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10105和106三種稀度，然后用無菌吸管分別由10105和106，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成1010101010106不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。 四、實(shí)驗(yàn)步驟流程 倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存。儀器或其它用具 無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。溶液或試劑10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基和菌種淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠，影響下一步工作的進(jìn)行。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。 土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。建立無菌操作