【正文】
。B（個）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000A圖15—1 血細胞計數(shù)板構(gòu)造（一） 圖15—2 血細胞計數(shù)板構(gòu)造（二）A. 正面圖；； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室；2. 蓋玻片；每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。血細胞計數(shù)板構(gòu)造如圖l51。用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、PeteroffHauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。2．掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。測定細胞物質(zhì)的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等。細菌群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或細胞物質(zhì)的增加。2．菌體大小測定結(jié)果：菌號大腸桿菌測定結(jié)果金黃色葡萄球菌的直徑大小測定結(jié)果目鏡測微尺格數(shù)實際長度目鏡測微尺格數(shù) 實際直徑/181。高倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。2．標定及測量方法示范。2．標定目鏡測微尺時要注意準確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。一般測量菌體的大小，應(yīng)測定10～20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。并詳細記錄于表15—1中。4．菌體大小的測定 將鏡臺測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。20=。兩條重合線間目鏡測微尺的格數(shù)3．計算方法標定公式：將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。鏡臺測微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個小格，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。三、操作步驟 l．測微尺的構(gòu)造 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。二、實驗材料和用具金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的玻片標本。內(nèi)容：1. 認識測微尺，學習目鏡測微尺的標定。實驗14 細菌大小的測定六、問題和思考1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點?2．濕室培養(yǎng)時為何用20%甘油作保濕劑?3．本實驗中觀察假根的設(shè)計原理是什么?此設(shè)計還適合于培養(yǎng)哪類菌。2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標本觀察結(jié)果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無假根、足細胞匍匐菌絲、囊軸等）四、注意事項載玻片濕室培養(yǎng)時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察。4．制成永久裝片 把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標本作較長期保存。3．假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。2．粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。 然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)（圖13—1）。(二)黑根霉假根的培養(yǎng)將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。5．倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。3．加培養(yǎng)基 用無菌細口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，(滴加量一般以l/2小滴為宜)。2．接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油。3．根霉假根的觀察。內(nèi)容：1．霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。實驗13 霉菌的形態(tài)觀察注：酵母菌的簡易培養(yǎng) 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調(diào)至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，聞到酒香味后，即可取培養(yǎng)液鏡檢。六、問題和思考1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2．如何區(qū)別營養(yǎng)細胞和釋放出的子囊孢子?3．試設(shè)計一個從子囊中分離子囊孢子的試驗方案。2．數(shù)個子囊及子囊孢子形態(tài)圖。3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。四、注意事項1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤?？梢姷窖恐辰湍感纬傻呐汗?jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2)。3個視野中（形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細胞總數(shù)）100%(4)計算子囊形成的百分率：計數(shù)時隨機取3個視野，分別計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細胞，然后按下列公式計算：制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。(2)轉(zhuǎn)接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀酒酵母轉(zhuǎn)接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)14d。3．酵母菌細胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。2．酵母菌液泡系的話體觀察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。死亡率=死細胞總數(shù)247。(3)在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)5～6個視野。三、操作步驟(一)酵母菌形態(tài)觀察1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。二、實驗材料和用具釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。2．觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。實驗12 酵母菌的形態(tài)觀察接種平板倒置于28℃，培養(yǎng) 5～7d。圖11—1 放線菌的插片與搭片培養(yǎng)示意圖A. 插片法； B. 搭片法2．制平板及鋪玻璃紙 取冷凝后的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將預(yù)先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)表面，鋪玻璃紙時可用無菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基之間的氣泡除去。然后進行濕熱滅菌，備用。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d（圖11—1B）。將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d。角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插人深度約占蓋玻片1/2長度(圖111A)。注：(一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1．插片法(1)制平板、接種：用冷卻至約50℃的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法接菌：先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種(接種量可適當加大)；先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進行。2．試比較5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同。2．玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，3．不同觀察方法中嚴格按要求進行，注意菌體的上下位置。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。用油鏡觀察。2．印片染色法觀察 用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動而破壞放線菌的自然形態(tài)。觀察棘孢小單孢菌時注意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細發(fā)亮，其單個分生孢子發(fā)暗，直接生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細觀察。制片時，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。(二)水封片觀察取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。三、操作步驟(一)觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。二、實驗材料和用具 細黃鏈霉菌(streptomycs micuoflavus)又稱5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃紙培養(yǎng)平皿。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：辨認放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學習放線菌的觀察方法。2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。2．供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。 (4) 在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。芽孢綠色，菌體紅色。(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。芽孢呈綠色，菌體紅色。(5)%沙黃水溶液(%堿性復紅)復染lmin，水洗。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、%沙黃水溶液(%堿性復紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾后備用)、95%乙醇、石炭酸復紅染液；顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。 2．細菌的莢膜染色。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：掌握細菌的芽孢及莢膜染色方法。2．試描述你所觀察的細菌有無運動性，是如何運動的?六、問題和思考1．鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?2．根據(jù)你的實驗體會，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?3．試設(shè)計一實驗，如何鑒別某種細菌是否能運動，是否有鞭毛，其鞭毛的著生位置。有些細菌，溫度太低時不能運動。染色時一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。圖9—1 懸滴標本的制備再用火柴棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。(2)在蓋玻片中央滴一小滴菌液（圖9—1A）(3)將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對準蓋玻片中央的菌液(圖91B)，輕輕地蓋在蓋玻片上，便凹玻片與蓋玻片粘在一起(注意液滴不得與凹玻片接觸)。要區(qū)分細菌鞭毛運動和布朗運動，后者只是在原處左右擺動，細菌細胞間有明顯位移者，才能判定為有運動性。(3)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(二)細菌運動的觀察1．壓滴法(1)制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。(5)待冷卻后，用蒸餾水輕輕沖洗干凈，自然干燥或濾紙吸干。(3)將殘水瀝干或用B液沖去殘水。3．染色(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。2．制片 在干凈載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用無菌操作法，以接種環(huán)從活化菌種中取少許菌苔(注意不要帶培養(yǎng)基)，在載玻片的水滴中輕沾幾下。三、操作步驟(一)細菌鞭毛染色1．活化菌種 將保存的變形菌在新制備的普通牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上連續(xù)移種2～3次，每次于30℃培養(yǎng)10～15h。二、實驗材料和用具普通變形菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。2．用壓滴法觀察細菌的運動。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解細菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；學習觀察細菌運動的方法。六、問題和思考1．涂片后為什么要進行固定?固定時應(yīng)注意什么?2．什