【正文】
。B（個(gè)）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000A圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（一） 圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（二）A. 正面圖；； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室；2. 蓋玻片；每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l51。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、PeteroffHauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等。細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。2．菌體大小測(cè)定結(jié)果：菌號(hào)大腸桿菌測(cè)定結(jié)果金黃色葡萄球菌的直徑大小測(cè)定結(jié)果目鏡測(cè)微尺格數(shù)實(shí)際長度目鏡測(cè)微尺格數(shù) 實(shí)際直徑/181。高倍鏡下 倍目鏡測(cè)微尺每格長度是 μm。2．標(biāo)定及測(cè)量方法示范。2．標(biāo)定目鏡測(cè)微尺時(shí)要注意準(zhǔn)確對(duì)正目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的重合線。一般測(cè)量菌體的大小，應(yīng)測(cè)定10～20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。并詳細(xì)記錄于表15—1中。4．菌體大小的測(cè)定 將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。20=。兩條重合線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)3．計(jì)算方法標(biāo)定公式：將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上。鏡臺(tái)測(cè)微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個(gè)小格，是專用于校正目鏡測(cè)微尺每格長度的。三、操作步驟 l．測(cè)微尺的構(gòu)造 顯微鏡測(cè)微尺是由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)接物測(cè)微尺組成，目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的玻片標(biāo)本。內(nèi)容：1. 認(rèn)識(shí)測(cè)微尺，學(xué)習(xí)目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定。實(shí)驗(yàn)14 細(xì)菌大小的測(cè)定六、問題和思考1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點(diǎn)?2．濕室培養(yǎng)時(shí)為何用20%甘油作保濕劑?3．本實(shí)驗(yàn)中觀察假根的設(shè)計(jì)原理是什么?此設(shè)計(jì)還適合于培養(yǎng)哪類菌。2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標(biāo)本觀察結(jié)果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細(xì)、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無假根、足細(xì)胞匍匐菌絲、囊軸等）四、注意事項(xiàng)載玻片濕室培養(yǎng)時(shí)，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察。4．制成永久裝片 把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標(biāo)本作較長期保存。3．假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。2．粘片觀察 取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。 然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)（圖13—1）。(二)黑根霉假根的培養(yǎng)將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。5．倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。3．加培養(yǎng)基 用無菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，(滴加量一般以l/2小滴為宜)。2．接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20%甘油。3．根霉假根的觀察。內(nèi)容：1．霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)13 霉菌的形態(tài)觀察注：酵母菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng) 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調(diào)至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，聞到酒香味后，即可取培養(yǎng)液鏡檢。六、問題和思考1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2．如何區(qū)別營養(yǎng)細(xì)胞和釋放出的子囊孢子?3．試設(shè)計(jì)一個(gè)從子囊中分離子囊孢子的試驗(yàn)方案。2．?dāng)?shù)個(gè)子囊及子囊孢子形態(tài)圖。3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細(xì)胞。四、注意事項(xiàng)1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤。可見到芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2)。3個(gè)視野中（形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細(xì)胞總數(shù)）100%(4)計(jì)算子囊形成的百分率：計(jì)數(shù)時(shí)隨機(jī)取3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細(xì)胞，然后按下列公式計(jì)算：制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。(2)轉(zhuǎn)接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀酒酵母轉(zhuǎn)接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)14d。3．酵母菌細(xì)胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。2．酵母菌液泡系的話體觀察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。死亡率=死細(xì)胞總數(shù)247。(3)在一個(gè)視野里計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計(jì)數(shù)5～6個(gè)視野。三、操作步驟(一)酵母菌形態(tài)觀察1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測(cè)定(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。2．觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。實(shí)驗(yàn)12 酵母菌的形態(tài)觀察接種平板倒置于28℃，培養(yǎng) 5～7d。圖11—1 放線菌的插片與搭片培養(yǎng)示意圖A. 插片法； B. 搭片法2．制平板及鋪玻璃紙 取冷凝后的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將預(yù)先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)表面，鋪玻璃紙時(shí)可用無菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基之間的氣泡除去。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d（圖11—1B）。將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d。角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插人深度約占蓋玻片1/2長度(圖111A)。注：(一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1．插片法(1)制平板、接種：用冷卻至約50℃的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法接菌：先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種(接種量可適當(dāng)加大)；先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進(jìn)行。2．試比較5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同。2．玻璃紙法培養(yǎng)接種時(shí)注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，3．不同觀察方法中嚴(yán)格按要求進(jìn)行，注意菌體的上下位置。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。用油鏡觀察。2．印片染色法觀察 用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動(dòng)而破壞放線菌的自然形態(tài)。觀察棘孢小單孢菌時(shí)注意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細(xì)發(fā)亮，其單個(gè)分生孢子發(fā)暗，直接生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細(xì)觀察。制片時(shí)，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。(二)水封片觀察取一滴美藍(lán)染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個(gè)分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。三、操作步驟(一)觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 細(xì)黃鏈霉菌(streptomycs micuoflavus)又稱5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃紙培養(yǎng)平皿。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：辨認(rèn)放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學(xué)習(xí)放線菌的觀察方法。2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。2．供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。 (4) 在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。芽孢綠色，菌體紅色。(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。芽孢呈綠色，菌體紅色。(5)%沙黃水溶液(%堿性復(fù)紅)復(fù)染lmin，水洗。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、%沙黃水溶液(%堿性復(fù)紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾后備用)、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅染液；顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。 2．細(xì)菌的莢膜染色。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：掌握細(xì)菌的芽孢及莢膜染色方法。2．試描述你所觀察的細(xì)菌有無運(yùn)動(dòng)性，是如何運(yùn)動(dòng)的?六、問題和思考1．鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?2．根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?3．試設(shè)計(jì)一實(shí)驗(yàn)，如何鑒別某種細(xì)菌是否能運(yùn)動(dòng)，是否有鞭毛，其鞭毛的著生位置。有些細(xì)菌，溫度太低時(shí)不能運(yùn)動(dòng)。染色時(shí)一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。圖9—1 懸滴標(biāo)本的制備再用火柴棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。(2)在蓋玻片中央滴一小滴菌液（圖9—1A）(3)將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液(圖91B)，輕輕地蓋在蓋玻片上，便凹玻片與蓋玻片粘在一起(注意液滴不得與凹玻片接觸)。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)，后者只是在原處左右擺動(dòng)，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才能判定為有運(yùn)動(dòng)性。(3)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(二)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的觀察1．壓滴法(1)制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。(5)待冷卻后，用蒸餾水輕輕沖洗干凈，自然干燥或?yàn)V紙吸干。(3)將殘水瀝干或用B液沖去殘水。3．染色(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。2．制片 在干凈載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用無菌操作法，以接種環(huán)從活化菌種中取少許菌苔(注意不要帶培養(yǎng)基)，在載玻片的水滴中輕沾幾下。三、操作步驟(一)細(xì)菌鞭毛染色1．活化菌種 將保存的變形菌在新制備的普通牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上連續(xù)移種2～3次，每次于30℃培養(yǎng)10～15h。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具普通變形菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。2．用壓滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解細(xì)菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的方法。六、問題和思考1．涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么?2．什