【正文】 動態(tài)觀察生長過程，根據(jù)菌絲和孢子的特點(diǎn)鑒定真菌類別。其正面和背景又可顯示各種不同顏色。絲狀菌落：是多細(xì)胞真菌的菌落形式。真菌菌落在形態(tài)上可分為三大類：酵母型菌落：與細(xì)菌菌落相似，圓形、白色、邊緣整齊、表面光滑濕潤。三、真菌的培養(yǎng)材料：菌種、沙保氏培養(yǎng)基、平皿、載玻片、蓋玻片。鏡檢時光線應(yīng)稍弱，使視野稍暗。制片：用小鑷子取少許皮（甲）屑標(biāo)本置于載玻片中央，滴12滴10%KOH溶液，覆加一蓋玻片，在火焰上緩慢加熱，以加速角質(zhì)溶解，使標(biāo)本透明，然后輕輕加壓使成薄片，驅(qū)走氣泡并吸去周圍溢液。二、皮膚絲狀菌的檢查材料：病人的甲屑、皮屑或毛發(fā)、10%KOH溶液、載玻片、蓋玻片、小鑷子、普通光學(xué)顯微鏡等。白色念珠菌菌體形態(tài)：用患者的棉拭子標(biāo)本常法涂片，革蘭氏染色，鏡檢。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察真菌的基本形態(tài)及菌落特點(diǎn)，了解淺部及深部真菌的檢查方法。實(shí)驗(yàn)十五 病原性真菌真菌是一大類不含葉綠素，無根、莖、葉，由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成的真核細(xì)胞型微生物。實(shí)驗(yàn)報告：1. 繪出典型的支原體菌落圖。（3）硝酸銀染液：硝酸銀5g，蒸餾水100ml。附：鍍銀染色液的配置（1）羅吉固定液：冰醋酸1ml，甲醛液2ml，蒸餾水100ml。鏡下牙垢中螺旋體呈棕褐色或黑褐色，有3~10個稀疏不規(guī)則的螺旋，呈波狀。（3）滴加媒染劑，加溫至有蒸汽出現(xiàn)，作用30min，水沖洗。 2. 牙垢中的螺旋體觀察（鍍銀染色法）（1）取玻片加生理鹽水1滴于中央，用牙簽取牙垢少許與鹽水均勻作一涂片。2. 掌握鍍銀染色檢查法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 鉤端螺旋體形態(tài)觀察（示教）鉤端螺旋體經(jīng)Fontana氏鍍銀染色，油鏡下的視野背景為淡黃棕色，螺旋體呈棕褐色至棕黑色。種類較多，對人類致病的主要有鉤端螺旋體、梅毒螺旋體、回歸熱螺旋體。姬姆薩染色呈淡紫色。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩гw菌落的形態(tài)特征。實(shí)驗(yàn)報告：繪出炭疽桿菌的形態(tài)圖，注意菌體大小、形態(tài)，芽胞的形狀及位置。芽胞橢圓形，位于菌體中央。菌體兩端平截、無鞭毛。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫J(rèn)識炭疽桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。本菌能在有氧的條件下產(chǎn)生芽胞。2. 記錄抗酸染色的步驟和繪染色結(jié)果圖，注明染色性和放大倍數(shù)。分裝于滅菌的中試管內(nèi)，85℃60分鐘間歇滅菌2次。無菌操作將卵白、卵黃一起打成全卵液，取500ml加入。附：改良羅氏培養(yǎng)基：，（），甘油6ml，溶于300ml蒸餾水中。③復(fù)染：加美蘭1~2滴，染色1分鐘，水洗，甩干，吸干。②脫色：用3%的鹽酸酒精數(shù)滴浸潤脫色，直至涂片無紅色染液脫下為止。（2）抗酸染色①初染：將石炭酸復(fù)紅滴于方框中，使標(biāo)本被充分浸潤，置于酒精燈火焰上方8厘米處，微微加熱，當(dāng)有水蒸氣冒出時，可再加少許石炭酸復(fù)紅，防止干涸，但也不能沸煮，如此加熱持續(xù)5分鐘。液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況：結(jié)核桿菌為專性需氧菌，在液體培養(yǎng)基中呈皺襞狀表皮生長。菌體被復(fù)紅染成紅色，其他細(xì)菌及背景物質(zhì)呈藍(lán)色。2．試劑：石炭酸復(fù)紅染液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭3．器具：顯微鏡、載玻片、酒精燈、試管夾、接種環(huán)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 結(jié)核桿菌的形態(tài)和染色特性油鏡下：結(jié)核桿菌為細(xì)長或略帶彎曲的桿菌，有的呈分枝狀。3. 掌握抗酸染色法的操作和結(jié)果判斷。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 掌握結(jié)核桿菌的形態(tài)和染色特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)十二 結(jié)核桿菌結(jié)核桿菌為細(xì)長分枝桿菌，有分枝生長趨勢，不易著色，經(jīng)加溫或延長時間后著色。4．厭氧袋法將接種好的平板放入裝有發(fā)生管和美蘭指示劑管的透明不透氣塑料袋內(nèi)，擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎緊，然后折斷發(fā)生管，產(chǎn)生的二氧化碳和氫氣使氣袋膨脹，出現(xiàn)水滴。利用兩種藥片：一種是枸櫞酸和小蘇打，另一種是硼氫化鈉。氣袋發(fā)生袋法：適合于床邊接種和野外厭氧菌培養(yǎng)。擰緊蓋子，用真空泵抽氣，當(dāng)指針到零時，灌入高純氮?dú)?，如此反?fù)2~3次，最后一次加入氫氣和二氧化碳的混合氣體。方法：抽氣換氣法：適合于實(shí)驗(yàn)室使用。試管法：將厭氧菌接種于小試管內(nèi)，并在一大試管內(nèi)放入有焦性沒食子酸的玻璃珠，滴入碳酸氫鈉，迅速把小試管放入大試管中去，并用橡膠塞塞緊，石蠟封口，置37攝氏度溫箱中培養(yǎng)。（100毫升容器中：1克焦性沒食子酸+2毫升0。方法：取置備好的庖肉培養(yǎng)基在火焰上微加熱，使凡士林熔化，在無菌條件下將厭氧菌接種，完畢后再微加熱，最后將培養(yǎng)基直立于試管架上，使凡士林密封后，在37溫箱中培養(yǎng)。1．庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)法原理：庖肉培養(yǎng)基內(nèi)含肉渣、不飽和脂肪酸、谷胱甘肽等物質(zhì)，表面由凡士林隔絕空氣。（2）產(chǎn)氣莢膜桿菌：在高層瓊脂中生長后，產(chǎn)生大量氣體，沖散凝固的瓊脂，將瓊脂推向試管口。產(chǎn)生的酸能把酪蛋白凝固，產(chǎn)生的大量氣體使凝固的酪蛋白呈蜂窩狀，大量氣體形成的高壓使酪蛋白和隔絕氧氣的凡士林石蠟沖向試管口，氣勢洶涌，稱為“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象，為本菌的特點(diǎn)之一。（2）產(chǎn)氣莢膜桿菌：在庖肉培養(yǎng)基中生長后，肉湯渾濁，肉渣不被消化，變成粉紅色，產(chǎn)生大量氣體，使液面固體石蠟推向上方。（1）破傷風(fēng)桿菌：在庖肉培養(yǎng)基中生長緩慢，厭氧培養(yǎng)2~7天后，培養(yǎng)基變混濁，產(chǎn)酸，肉渣部分消化微變黑，有少量氣體。繁殖體革蘭氏染色陽性。莢膜染色法可見肥厚莢膜；芽胞呈卵圓形，與菌體等寬，位于中央或次極端。（2）產(chǎn)氣莢膜桿菌 兩端鈍圓，長4~8微米，寬1~。用芽胞染色法菌體染成藍(lán)色，芽胞染成紅色。無莢膜，芽胞球形，位于菌體頂端，直徑大于菌體，呈鼓槌或火柴棒狀，為本菌鑒定特征之一。5微米。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的形態(tài)特征 （1）破傷風(fēng)桿菌細(xì)長桿菌，長4~8微米，寬0。3．高層培養(yǎng)基中的破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)材料：1．破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的庖肉培養(yǎng)物。2. 熟悉重要的厭氧菌的培養(yǎng)特性。前者致病菌主要有破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒桿菌等；后者臨床上以革蘭氏陰性桿菌多見，尤其是脆弱類桿菌。實(shí)驗(yàn)十一 厭氧性細(xì)菌厭氧性細(xì)菌是一大類專性厭氧，必須在無氧的環(huán)境下才能生長的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)報告：1．記錄上次雙糖鐵培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基接種的結(jié)果（繪圖并分析）；2．記錄玻片凝集試驗(yàn)的結(jié)果（繪圖并分析）；3．結(jié)合腸道致病菌的系列檢查結(jié)果作出最后鑒定。細(xì)菌的色素，在室溫、有氧、含血清、牛乳等培養(yǎng)基中產(chǎn)生豐富。色素分為兩類：脂溶性色素：僅菌落本身著色，培養(yǎng)基不染上顏色。沿穿刺線部位呈現(xiàn)黑色為陽性，無黑色出現(xiàn)為陰性。 ②醋酸鉛培養(yǎng)基的制備：、%的肉湯瓊脂中，~, 分裝試管，每管約3~4ml。取出培養(yǎng)物后，加入2~3滴乙醚，混勻靜置（使無色吲哚和乙醚一并上升至液體表面），再沿管壁加入2~3滴靛基質(zhì)試劑于培養(yǎng)物表面，在兩者接觸面上呈玫瑰紅色為陽性，黃色為陰性。②蛋白胨水培養(yǎng)基的制備：將蛋白胨1g、分裝試管，每管約3~4ml。③方法與結(jié)果：用滅菌接種環(huán)分別取大腸桿菌和傷寒桿菌少許，分別接種于五種糖發(fā)酵管，經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時，觀察結(jié)果；ⅰ.糖不分解，指示劑仍為紫色，記錄方式（—）；ⅱ.糖分解（產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）指示劑變黃，小倒管中無氣泡，記錄方式（+）；ⅲ. 糖分解（產(chǎn)酸且產(chǎn)氣）指示劑變黃，小倒管中有氣泡，記錄方式（ ）（+） （ ）氣泡 黃色單糖發(fā)酵試驗(yàn)（2）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)：①原理：各種細(xì)菌分解氨基酸的能力不同，借此可鑒別菌種。在五瓶液體中分別加入五種糖，糖的最終濃度為1%。因此可協(xié)助鑒別細(xì)菌，尤其是腸道細(xì)菌；②單糖發(fā)酵管的制備：%。4. 細(xì)菌代謝產(chǎn)物的觀察觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長情況，參照前表（腸道桿菌生物學(xué)性狀）分析并作出初步鑒定，依照此結(jié)果，再用其他生化反應(yīng)來作最后鑒定。 +（陰性）（陽性）記錄結(jié)果之后，將玻片放入含消毒液的指定容器內(nèi)，切勿任意放置或沖洗。陰性：液體仍然混濁，無凝集塊出現(xiàn)。注意無菌操作。方法 取潔凈玻片1張，用記號筆劃分三等份，如下圖所示： 用接種環(huán)分別取生理鹽水、1：20傷寒桿菌免疫血清、1：20痢疾桿菌免疫血清各34環(huán)按圖示位置放在玻片上，注意在換取另一種血清時要燒灼接種環(huán)，以免混淆血清產(chǎn)生錯誤結(jié)果。 待檢菌培養(yǎng)物。原理 將已知細(xì)菌抗體與待測細(xì)菌混合，如果抗原與抗體相對應(yīng)，則引起細(xì)菌凝集，反之則不凝集，據(jù)其凝集現(xiàn)象可判斷細(xì)菌種類。結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果、SS平板的培養(yǎng)結(jié)果、雙糖鐵培養(yǎng)結(jié)果、半固體培養(yǎng)結(jié)果作出初步診斷。發(fā)酵乳糖的細(xì)菌使斜面和底層均呈黃色，可有氣泡產(chǎn)生；若只發(fā)酵葡萄糖，則因葡萄糖含量少，生成少量的酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，并因細(xì)菌生長繁殖利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面呈紅色，底層由于缺氧，細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖生成酸類物質(zhì)不氧化而保持黃色；如細(xì)菌分解蛋白質(zhì)中的胱氨酸產(chǎn)生硫化氫，則與硫酸亞鐵作用生成黑色的硫化亞鐵沉淀，使培養(yǎng)基變黑。 腸道非致病菌： 斜面黃色， 底層黃色，可能有氣泡。方法：詳見實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的分離和培養(yǎng)中的半固體接種法。除糖類和酚紅外，其他各成分均加熱溶解，~，再加入糖類和酚紅水溶液，混勻，過濾分裝，每管3ml，取出后制成斜面，斜面和底層各占1/2。貼上標(biāo)簽紙。表81 大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌的生物學(xué)特征特性菌名形態(tài)、排列及染色性在SS平板上的菌落表現(xiàn)生化反應(yīng)動力吲哚乳糖葡萄糖H2S大腸桿菌桿狀，散在排列，G—菌落較大，不透明，呈紅色+—++痢疾桿菌同上菌落小，半透明，無色或淡黃色—+——+/—傷寒桿菌同上菌落較小，半透明，無色或淡黃色—++/—+—注：㊣產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“+”產(chǎn)酸或陽性，“—”陰性 2．雙糖鐵培養(yǎng)基的接種從SS培養(yǎng)基上挑取較小的無色或淡黃色菌落，可先做革蘭氏染色鏡檢，然后再接種于雙糖鐵培養(yǎng)基中（為觀察比較，同組四人應(yīng)取大小或顏色不同的兩個菌落分別接種于兩支雙糖鐵，并作好標(biāo)記）。較大的紅色菌落是腸道致病菌，較小的半透明的淡黃色或無色菌落是腸道致病菌。實(shí)驗(yàn)九 腸道桿菌的鑒定（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：