【正文】 紙和濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片，用水浸泡后把濕濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中，借濾紙將玻璃紙隔開。然后進行濕熱滅菌，備用。2. 營養(yǎng)菌絲的觀察 (1) 用接種鏟連同培養(yǎng)基挑取細黃鏈霉菌菌苔置載玻片中央。 (2) 用另一載玻片將其壓碎，棄去培養(yǎng)基，制成涂片，干燥，固定。 (3) ，水洗。 (4) 干燥后，用油鏡觀察營養(yǎng)菌絲的形態(tài)。3. 氣生菌絲與營養(yǎng)菌絲的比較觀察。 (1) 將高氏Ⅰ號培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，制成4mm左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)后無菌，備用。 (2) 用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)，然后將細黃鏈霉菌的孢子懸液（濃度以稀釋102～103為好），接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。 (3) 倒置于28℃培養(yǎng)4～5天后，小心的將蓋玻片取出，把有菌的一面朝上，放在載玻片上，置顯微鏡下進行觀察。一般情況是氣生菌絲顏色較深，并比營養(yǎng)菌絲粗二倍左右。4. 孢子絲及孢子的觀察 (1) 將培養(yǎng)3～4天的細黃鏈霉菌的培養(yǎng)皿打開，放在顯微鏡低倍鏡下尋找菌落的邊緣，直接觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)，注意分枝情況、卷曲情況等。 (2) 取清潔的蓋玻片一塊，在菌落上面輕輕的按壓一下，然后將印有痕跡的一面朝下放在有一滴呂氏堿性美藍染液的載玻片上，將孢子等印浸在染液中，制成印片。用油鏡觀察孢子的形態(tài)，孢子絲等。 (3) 用小刀切取細黃鏈霉菌培養(yǎng)物一塊（帶培養(yǎng)基切下）。菌面朝上放在一載玻片上，另取一潔凈載玻片置火焰上微熱后，蓋在菌苔上，輕輕按壓，使培養(yǎng)物（氣絲、孢子絲或孢子）印在后一塊載玻片的中央，注意不要使培養(yǎng)物在玻片上滑動，否則印痕模糊不清。將制好的印片通過火焰23次固定，用石炭酸復(fù)紅染色1min，水洗，晾干。用油鏡觀察孢子絲的形態(tài)及孢子排列情況。實驗報告：1．在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2．玻璃紙培養(yǎng)和觀察法是否還可用于其他類型微生物的培養(yǎng)和觀察?為什么?3． 繪圖說明你觀察到的放線菌的主要形態(tài)特征。實驗九 細菌的芽胞染色實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)細菌的芽胞染色法，初步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征。實驗原理：細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設(shè)計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當(dāng)染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。實驗器材：培養(yǎng)36小時的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或者蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。：5%孔雀綠水溶液，%番紅水溶液。3. 儀器或其他用具：小試管（75mm10mm），燒杯（300mL），滴管，接種環(huán)，擦鏡紙，鑷子，顯微鏡等。實驗內(nèi)容：（1）制備菌懸液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。（3）加熱：將此試管浸于沸水浴的燒杯中，加熱15—20min。（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次固定。（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。（7）復(fù)染：加番紅染液染色23min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細菌制成涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次固定。（3）染色：加數(shù)滴5%孔雀綠染液于涂片處，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染液冒蒸汽并開始計算時間，維持5min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水無色為止。用番紅染液復(fù)染2min。（4）水洗：用緩水流洗后，吸干。（5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。注意事項。、簡化操作及提高標本質(zhì)量等方面都較常規(guī)涂片法優(yōu)越，可優(yōu)先使用。用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應(yīng)先用接種環(huán)充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。實驗報告：1．繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖。2．說明芽胞染色法的原理。用簡單染色法能否觀察到細菌的芽孢？3．用SchaefferFulton氏染色法加熱染色時，若因一時疏忽玻片上的染液被烘干，此時是否立即補加染液？為什么？4．若涂片上所觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營養(yǎng)細胞，你認為這是什么原因？實驗十 微生物菌種保藏實驗?zāi)康模?．了解菌種常規(guī)保藏方法的基本原理，掌握幾種常用的菌種保藏方法。 2． 理解冷凍干燥保藏菌種的原理 ，掌握冷凍干燥保藏菌種的方法。實驗原理：菌種是一種重要的生物資源，菌種保藏是重要的微生物基礎(chǔ)工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、不衰、不變，以便于研究與應(yīng)用。菌種保藏的方法很多，其原理卻大同小異，不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境，即干燥、低溫、缺乏氧氣和養(yǎng)料等。使微生物的代謝活動處于最低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達到保藏的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求，應(yīng)該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜面保藏、半固體穿刺，石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易制作。實驗器材：：細菌、酵母菌、放線菌和霉菌。2．培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)細菌)，麥芽汁培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)酵母菌)，高氏1號培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)放線菌)，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基斜面(培養(yǎng)絲狀真菌)。：無菌水，液體石蠟，P2O5，脫脂奶，10%HCl，干冰，95%乙醇。4. 儀器或其他用具：無菌試管，無菌吸管(1mL及5mL)，無菌滴管，接種環(huán)，40目及100目篩子，干燥器，安瓿管，冰箱，冷凍真空干燥裝置，酒精噴燈，三角燒瓶(250mL)， 瘦黃土(有機物含量少的黃土)，食鹽、河沙。實驗內(nèi)容：下列各方法可根據(jù)實驗室具體條件與需要選做。(一)斜面?zhèn)鞔２胤╨．貼標簽 取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2～3cm處。2．斜面接種 將待保藏的菌種用接種環(huán)以無菌操作法移接至相應(yīng)的試管斜面上，細菌和酵母菌宜采用對數(shù)生長期的細胞，而放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子。3．培養(yǎng) 細菌37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，酵母菌于28～30℃培養(yǎng)36～60h，放線菌和絲狀真菌置于28℃培養(yǎng)4～7d。4．保藏 斜面長好后，可直接放入4℃冰箱保藏。為防止棉塞受潮長雜菌，管口棉花應(yīng)用牛皮紙包扎，或換上無菌膠塞，亦可用熔化的固體石蠟熔封棉塞或膠塞。保藏時間依微生物種類而不同，酵母菌、霉菌、放線菌及有芽抱的細菌可保存2～6個月，移種一次；而不產(chǎn)芽孢的細菌最好每月移種一次。此法的缺點是容易變異，污染雜菌的機會較多。(二)液體石蠟保藏法l．液體石蠟滅菌 在250mL三角燒瓶中裝入100mL液體石蠟，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，12l℃濕熱滅菌30min，然后于40℃溫箱中使水汽蒸發(fā)后備用。2．接種培養(yǎng) 同斜面?zhèn)鞔２胤ā?．加液體石蠟 用無菌滴管吸取液體石蠟以無菌操作加到已長好的菌種斜面上，加入量以高出斜面頂端約1cm為宜。4．保藏 棉塞外包牛皮紙，將試管直立放置于4℃冰箱中保存。利用這種保藏方法，霉菌、放線菌、有芽孢細菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右。5. 恢復(fù)培養(yǎng) 用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，在試管壁上輕靠幾下，盡量使石蠟油滴凈，再接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于菌體表面粘有液體石蠟，生長較慢且有粘性，故一般須轉(zhuǎn)接2次才能獲得良好菌種。(三)沙土管保藏法l．沙土處理(1)沙處理：取河沙經(jīng)40目過篩，去除大顆粒，加10%HCl浸泡(用量以浸沒沙面為宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有機雜質(zhì)，然后倒去鹽酸，用清水沖洗至中性，烘干或曬干，備用。(2)土處理：取非耕作層瘦黃土(不含有機質(zhì))，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目過篩，去除粗顆粒后備用。2．裝沙土管 將沙與土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均勻裝入試管中(10mm100mm，裝置約7cm高，加棉塞，并外包牛皮紙，12l℃濕熱滅菌30min，然后烘干。3．無菌試驗 每10支沙土管任抽一支，取少許沙土接入牛肉膏蛋白胨或麥芽汁培養(yǎng)液中，在最適的溫度下培養(yǎng)2～4d，確定無菌生長時才可使用。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，經(jīng)重新滅菌后，再作無菌試驗，直到合格。4．制備菌液 用5mL無菌吸管分別吸取3mL無菌水至待保藏的菌種斜面上，用接種環(huán)輕輕攪動，制成懸液。5．加樣 ～，用接種環(huán)拌勻。加入菌液量以濕潤沙土達2/3高度為宜。6．干燥 將含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器內(nèi)用培養(yǎng)皿盛P2O5作為干燥劑，可再用真空泵連續(xù)抽氣3～4h，加速干燥。將沙土管輕輕一拍，沙土呈分散狀即達到充分干燥。7．保藏沙土管可選擇下列方法之一來保藏： (1)保存于干燥器中； (2)用石蠟封住棉花塞后放入冰箱保存； (3)將沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存； (4)將沙土管裝入有CaCl2等干燥劑的大試管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蠟封口，放入冰箱中或室溫下保存。8．恢復(fù)培養(yǎng) 使用時挑取少量混有孢子的沙土，接種于斜面培養(yǎng)基上，或液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)即可，原沙土管仍可繼續(xù)保藏。此法適用于保藏能產(chǎn)生芽孢的細菌及形成孢子的霉菌和放線菌，可保存2年左右。但不能用于保藏營養(yǎng)細胞。(四)冷凍干燥保藏法1．準備安瓿管 選用內(nèi)徑5mm，用10%HCl浸泡8～10h后用自來水沖洗多次，最后用去離子水洗1～2次，烘干，將印有菌名和接種日期的標簽放人安瓿管內(nèi)，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃滅菌30min。2．制備脫脂牛奶 將脫脂奶粉配成20%乳液，然后分裝，121℃滅菌30min，并作無菌試驗。3．準備菌種 選用無污染的純菌種，培養(yǎng)時間，一般細菌為24～48h，酵母菌為3d，放線菌與絲狀真菌7～10d。4．制備菌液及分裝 吸取3mL無菌牛奶直接加入斜面菌種管中，用接種環(huán)輕輕攪動菌落，再用手搖動試管，制成均勻的細胞或孢子懸液。用無菌長滴管將菌液分裝于安瓿管底部。5. 預(yù)凍 將安瓿管外的棉花剪去并將棉塞向里推至離管口約15mm處，再通過乳膠管把安瓿管連接于總管的側(cè)管上，總管則通過厚壁橡皮管及三通短管與真空表及干燥瓶、真空泵相連接，并將所有安瓶管浸入裝有干冰和95%乙醇的預(yù)冷槽中，(此時槽內(nèi)溫度可達40～50℃)，只需冷凍1h左右，即可使懸液凍結(jié)成固體。6. 真空干燥 完成預(yù)凍后，升高總管使安瓿管僅底部與冰面接觸，(此處溫度約10℃)，以保持安韶管內(nèi)的懸液仍呈固體狀態(tài)。開啟真空泵后，應(yīng)在5～，使被凍結(jié)的懸液開始升華，～，凍結(jié)樣品逐漸被干燥成白色片狀，此時使安瓿管脫離冰浴，在室溫下(2530℃)繼續(xù)干燥(管內(nèi)溫度不超過30℃)，升溫可加速樣品中殘余水分的蒸發(fā)?？偢稍飼r間應(yīng)根據(jù)安瓿管的數(shù)量，懸浮液裝量及保持劑性質(zhì)來定，一般34h即可。7．封口樣品 ，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精噴燈火焰灼燒，拉成細頸并熔封，然后置4℃冰箱內(nèi)保藏。8．恢復(fù)培養(yǎng) 用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上燒熱安瓿管上部，然后將無菌水滴在燒熱處，使管壁出現(xiàn)裂縫，放置片刻，讓空氣從裂縫中緩慢進入管內(nèi)后，將裂口端敲斷，再用無菌的長頸滴管吸取菌液至合適培養(yǎng)基中，放置在最適溫度下培養(yǎng)。冷凍干燥保藏法綜合利用了各種有利于菌種保藏的因素(低溫、干燥和缺氧等)，是目前最有效的菌種保藏方法之一。保存時間可長達10年以上。注意事項1．從液體石蠟封藏的菌種管中挑菌后，接種環(huán)上帶有石蠟油和菌，故接種環(huán)在火焰上滅菌時要先在火焰邊烤干再直接灼燒，以免菌液四濺，引起污染。2．在真空干燥過程中安瓿管內(nèi)樣品應(yīng)保持凍結(jié)狀態(tài)，以防止抽真空時樣品產(chǎn)生泡沫而外溢。3．熔封安瓿管時注意火焰大小要適中，封口處灼燒要均勻，若火焰過大，封口處易彎斜，冷卻后易出現(xiàn)裂縫而造成漏氣。實驗報告：1．簡述真空冷凍干燥保藏菌種的原理。 2．菌種保藏中，石蠟油的作用是什么？ 3．經(jīng)常使用的細菌菌株，使用哪種保藏方法比較好？ 4．沙土管法適合保藏哪一類微生物？27 / 28