【正文】 5自制乳酸質(zhì)量品嘗。二、實(shí)驗(yàn)材料1嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌。2 BCG牛乳培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基、脫脂乳試管、脫脂乳粉或全脂乳粉、鮮牛奶、蔗糖、碳酸鈣。3恒溫水溶鍋、酸度計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、酸乳瓶(200280ml)、培養(yǎng)皿、試管、300mL三角瓶。三、 實(shí)驗(yàn)方法和步驟(一)乳酸菌的分離純化1分離：取市售新鮮酸乳或泡制酸菜的酸液稀釋至105，取其中的10分別接人BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，用無菌涂布器依次涂布；或者直接用接種環(huán)沾取原液平扳劃線分離，置40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。2鑒別：選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)824h，若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀(兩種形狀的菌種均分別選入)，革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續(xù)傳代46次，最終選擇出在36h能凝固的牛乳管，作菌種待用。(二)乳酸發(fā)酵及檢測1發(fā)酵：在無菌操作下將分離的1株乳酸菌接種于裝有300mL乳酸菌培養(yǎng)液的500mL三角瓶中，4042℃靜止培養(yǎng)。2檢測：為了使于測定乳酸發(fā)酵情況，實(shí)驗(yàn)分2組。一組在接種培養(yǎng)后，每68h取樣分析，測定PH值；另一組在接種培養(yǎng)24h后每瓶加入CaCO3 (以防止發(fā)酵液過酸使菌種死亡)，每68h取樣，測定乳酸含量，記錄測定結(jié)果。(三)乳酸菌飲料的制作1將脫脂乳和水以1:710(W／V)的比例，同時(shí)加入5％6％蔗糖，充分混合，于8085℃滅菌1015min，然后冷卻至3540℃，作為制作飲料的培養(yǎng)基質(zhì)。2將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌及兩種菌的等量混合菌液作為發(fā)酵劑，均以2％5％的接種量分別接人以上培養(yǎng)基質(zhì)中即為飲料發(fā)酵液，亦可以市售鮮酸乳為發(fā)酵劑。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發(fā)酵液重復(fù)分裝35瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封。3把接種后的酸乳瓶置于4042℃恒溫箱中培養(yǎng)34h。培養(yǎng)時(shí)注意觀察，在出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入45℃的低溫下冷藏24h以上。經(jīng)此后熟階段，達(dá)到酸乳酸度適中(pH )，凝塊均勻致密，無乳清析出，無氣泡，獲得較好的口感和特有風(fēng)味。4以品嘗為標(biāo)被評(píng)定酸乳質(zhì)量，采用乳酸球菌和乳酸桿菌等量混合發(fā)酵的酸乳與單菌株發(fā)酵的酸乳相比較，前者的香味和口感更佳，品嘗時(shí)若出現(xiàn)異昧，表明酸乳污染了雜菌。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告1在BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上乳酸菌的黃色菌落典型特征和鏡檢細(xì)胞學(xué)特征。2已發(fā)酵的乳酸菌飲料凝乳情況觀察。3乳酸發(fā)酵過程、檢測結(jié)果及結(jié)果分析。4將發(fā)酵的酸乳品評(píng)結(jié)果記錄于表中。五、問題和思考1發(fā)酵酸乳為什么能引起凝乳？2為什么采用乳酸菌混合發(fā)酵的酸乳比單菌發(fā)酵的酸乳口感和風(fēng)味更佳?3試設(shè)計(jì)一個(gè)從市售鮮酸乳中分離純化乳酸菌和制作乳酸菌飲料的程序。六、注意事項(xiàng)1采用BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌時(shí)，注意挑取典型持征的黃色菌落，結(jié)合鏡檢觀察，有利高效分離篩選乳酸菌。2制作乳酸菌飲料，應(yīng)選用優(yōu)良的乳酸菌，采用乳酸球菌與乳酸桿菌等量混合發(fā)酵，使其具有獨(dú)特風(fēng)昧和良好口感。3牛乳的消毒應(yīng)掌握適宜溫度和時(shí)間，防止長時(shí)間采用過高溫度消毒而破壞酸乳風(fēng)味。4作為衛(wèi)生合格標(biāo)淮還應(yīng)按衛(wèi)生部規(guī)定進(jìn)行檢測，如大腸菌群檢測等。經(jīng)品嘗和檢驗(yàn)的酸乳應(yīng)在4℃條件下冷藏，可保持67d。實(shí)驗(yàn)二、固定化枯草芽孢桿菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)α淀粉酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)制備固定化微生物活細(xì)胞的方法。2了解固定化活細(xì)胞發(fā)酵連續(xù)產(chǎn)酶的特性。3使用固定化細(xì)胞及利用玻璃管硫化床反應(yīng)器連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)α淀粉酶。二、實(shí)驗(yàn)材料1 枯草芽孢桿菌。2 產(chǎn)淀粉酶種子培養(yǎng)液、產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)液、4%海藻酸鈉溶液、（）、無菌生理鹽水（%NaCl）。3 玻璃管流化床反應(yīng)器(直徑3cm，高20 cm，管外套加循環(huán)水套)、空氣濾器、空氣流量計(jì)、恒流泵、磁力攪拌器、5L發(fā)酵罐、水浴鍋、500mL三角瓶、試管、比色用帶孔白瓷板。三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1菌體準(zhǔn)備在無菌操作條件下，將滅菌的種子培養(yǎng)液按每瓶100mL分裝于500mL三角瓶中，將活化的枯草芽孢桿菌α淀粉酶菌株接種于以上培養(yǎng)液中，37℃120r／min振蕩培養(yǎng)16h作菌種。按10％的接種量接種于裝有無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中。維持37℃攪拌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期(約24h)，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次。將收集的菌糊用生理鹽水以10g／100mL制成菌懸液。2固定化細(xì)胞的制備在37℃條件下，將菌懸液與經(jīng)115℃滅菌30min的4％海藻酸鈉溶液等體積混合，放在磁力攪拌器上保持低速攪拌。以細(xì)塑膠管連接恒流泵和菌體海藻酸鈉懸液，在恒流泵的輸送下，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱過夜。取出后經(jīng)無菌生理鹽水洗滌2次，制成直徑約1mm的固定化枯草芽孢桿菌細(xì)胞膠珠，菌體包埋在海藻酸鈣凝膠中，即制成固定化細(xì)胞。3固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)α淀粉酶先將玻璃管流化床反應(yīng)器滅菌，然后在進(jìn)氣口連接空氣流量計(jì)和空氣過濾器。在水循環(huán)外套的入口處連接水浴鍋和溫水循環(huán)裝置，使固定化細(xì)胞反應(yīng)器溫度維持在37℃。在玻璃管流化床反應(yīng)器內(nèi)裝入70g固定化細(xì)胞膠珠。開啟恒流泵后，發(fā)酵培養(yǎng)液便流加進(jìn)入反應(yīng)器，反應(yīng)器中供給無菌空氣。培養(yǎng)后的發(fā)酵液由反應(yīng)器頂部流出，收集發(fā)酵液，于4℃冰箱保存，用于測定α淀粉酶活性。4 α淀粉酶活性測定對(duì)收集的發(fā)酵液，可直接進(jìn)行α淀粉酶活性測定，也可經(jīng)超濾濃縮510倍后測定濃縮液的酶活性。α淀粉酶活性測定程序如下：（1）吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)糊精液，轉(zhuǎn)入裝有3mL標(biāo)準(zhǔn)碘液的試管中，以此作為比色的標(biāo)準(zhǔn)管(或者吸取2mL轉(zhuǎn)入比色用白瓷板的空穴內(nèi)，作為比色標(biāo)準(zhǔn))。（2）在25 x 20cm試管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加PH ，在60℃水浴中平衡約5min，立即計(jì)時(shí)并充分混勻。定時(shí)取出1mL反應(yīng)液于預(yù)先盛有比色稀碘液的試管內(nèi)()，當(dāng)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)樽爻壬?，與標(biāo)準(zhǔn)色相同時(shí)，即為反應(yīng)終點(diǎn)，記錄時(shí)間。以末發(fā)酵的培養(yǎng)液作為測定酶活性的空白對(duì)照液。（3）計(jì)算淀粉酶活力酶活力/=(60/t2020%n)247。式中t為反應(yīng)時(shí)間，n為酶稀釋倍數(shù)，（mL）。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告1記錄所收集發(fā)酵液的α淀粉酶活性，并根據(jù)測定結(jié)果闡述固定化細(xì)胞的產(chǎn)酶特點(diǎn)。2試說明兩粒包埋膠珠的平板活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果及光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果。五、問題和思考1制備固定化細(xì)胞的操作中，重點(diǎn)應(yīng)掌握哪幾個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)?此法最適用于那類酶的生產(chǎn)，2結(jié)合本實(shí)驗(yàn)學(xué)到的知識(shí)，試?yán)L出利用固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)胞外酶的流程圖，并標(biāo)明各部位。六、注意事項(xiàng)1將菌體海藻酸鈉懸液滴入CaCl溶液中時(shí)要逐滴滴入，不要連成線狀，對(duì)CaCl溶液要低速輕輕的磁力攪拌，以形成均勻的膠珠。2要控制培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度，防止過高。流加的培養(yǎng)基要保持—定濃度的鈣離子，以維持海藻酸鈣凝膠的穩(wěn)定性。3測定α淀粉酶活性的可溶性淀粉和標(biāo)準(zhǔn)糊精液，要低溫保存，注意防腐，其標(biāo)準(zhǔn)管應(yīng)做到當(dāng)天使用當(dāng)天配制，并注意防腐和冰箱低溫保存。第三部分 綜 合 性 實(shí) 驗(yàn)微 生 物 的 誘 變 育 種一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊宰贤饩€誘變獲得用于醬油生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌株為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1米曲霉斜面菌種。2豆餅斜面培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、蒸餾水、％酪蛋白。3三角瓶(250mL、500mL)、試管、培養(yǎng)皿(9cm)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈。三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟(一)出發(fā)菌株的選擇及菌懸液制備l出發(fā)菌株的選擇：可直接選用生產(chǎn)醬油的米曲霉菌株，或選用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株。2菌懸液制備：取出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接至豆餅斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)35d活化。(內(nèi)裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿瓶底為宜)，30℃振蕩30min，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾，制成孢子懸液，調(diào)其濃度為106108個(gè)／mL，冷凍保藏備用。(二)誘變處理可用物理方法或化學(xué)方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定，有時(shí)還可采用復(fù)合處理，可獲得更好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用紫外線照射的誘變方法。1紫外線處理：打開紫外燈(30w)預(yù)熱20min。取5mL菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿(9cm)中，同時(shí)制作5份。逐一操作，將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照射1min后打開培養(yǎng)皿蓋，開始照射，與照射處理開始的同時(shí)打開磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，即時(shí)計(jì)算時(shí)間。照射時(shí)間分別為15s、30s、1min、2 min、5 min。照射后，誘變菌液在黑暗冷凍中保存12h，然后在紅燈下稀釋涂菌進(jìn)行初篩。2稀釋菌懸液：按10倍稀釋至106，(每個(gè)稀釋度均做3個(gè)重復(fù))，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，于30℃恒溫培養(yǎng)23d。(三)優(yōu)良菌株的篩選1初篩：首先觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小，并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落4050個(gè)，作為復(fù)篩菌株。2平板復(fù)篩：分別倒酪素培養(yǎng)基平板，在每個(gè)平皿的背面用紅筆劃線分區(qū)，從圓心劃線至周邊分成8等份，17份中點(diǎn)種初篩菌株，第8份點(diǎn)種原始菌株，作為對(duì)照。培養(yǎng)48h后即可見生長，若出現(xiàn)明顯的透明圈，即可按初篩方法檢測，獲得數(shù)株二次優(yōu)良菌株，進(jìn)入搖瓶復(fù)篩階段。3搖瓶復(fù)篩：將初篩出的菌株，接入米曲霉復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其方法是：稱取麥麩85g，豆餅粉(或面粉)15g，加水95110mL(稱為潤水)，水含量以手捏后指縫有水而不下滴為宜，于500mL三角瓶中裝入1520g()，12l℃濕熱滅菌30min，然后分別接入以上初篩獲得的優(yōu)良菌株，30℃培養(yǎng)，24h后搖瓶一次并均勻鋪開，再培養(yǎng)2448h，共培養(yǎng)35d后檢測蛋白酶活性。4蛋白酶的測定方法(1)取樣：培養(yǎng)后隨機(jī)稱取以上搖瓶培養(yǎng)物1g，加蒸餾水100mL或200mL)，40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液測定酶活性。另取1g培養(yǎng)物于105℃烘干測定含水量。(2)酶活性測定：30℃pH 75條件下水解酪蛋白(％酪蛋白)，每分鐘產(chǎn)酪氨酸1ug為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式為：(A樣品OD680值A(chǔ)對(duì)照OD680值)KV／TNK：標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收為“1”時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；V：酶促反應(yīng)的總體積；t：酶促反應(yīng)時(shí)間(min)；N：酶的稀釋倍數(shù)。5谷氨酸的檢測：此項(xiàng)檢測也是醬油優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一。檢測培養(yǎng)基：豆餅粉：麩皮=6:4，潤水75％，12l℃濕熱滅菌30min。谷氨酸測定：于以上培養(yǎng)基中加入7%鹽水（W/V），4045℃水浴，水解9d后過濾，以濾液檢測谷氨酸含量（測壓法）四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1試列表說明高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選過程和結(jié)果。2你認(rèn)為以上的篩選方法有什么優(yōu)缺點(diǎn)，如何改進(jìn)?五、問題和思考1試述紫外線誘變的作用機(jī)理及其在具體操作中應(yīng)注意的問題。2為什么在誘變時(shí)要把菌懸液打散和培養(yǎng)一段時(shí)間?六、注意事項(xiàng)1紫外線照射時(shí)注意保護(hù)眼睛和皮膚。2誘變過程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進(jìn)行，并在黑暗中培養(yǎng)。30 / 30