【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長(zhǎng)和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度計(jì)算出菌體的長(zhǎng)和寬。并詳細(xì)記錄于表中，最后，求出平均值，才能代表該菌的大小。（酵母菌大小的測(cè)定）四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)告五、問(wèn)題和思考1 為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)必須重新用鏡臺(tái)測(cè)微尺對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定?2若目鏡不變，目鏡測(cè)微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測(cè)微尺每格所測(cè)量的鏡臺(tái)上的菌體細(xì)胞的實(shí)際長(zhǎng)度(或?qū)挾?是否相同?為什么?六、注意事項(xiàng)1鏡臺(tái)測(cè)微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時(shí)，要格外注意，以免壓碎鏡臺(tái)測(cè)微尺或損壞鏡頭。2標(biāo)定目鏡測(cè)微尺時(shí)要注意淮確對(duì)正目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的重合線(xiàn)。目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺的顯微鏡下示范。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)菌的生理生化反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)菌鑒定中常用的主要生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)法及其原理。3比較4種菌的甲基紅反應(yīng)結(jié)果。4比較4種菌的吲哚反應(yīng)結(jié)果。5學(xué)習(xí)使用杜氏小管進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，并比較3種菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果。二、實(shí)驗(yàn)材料1大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌的斜面菌種。2葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)。3 40％NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、％溴甲酚紫指示劑。4超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟(一) 1 試管標(biāo)記：以5支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿和空白對(duì)照。2接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照不接菌。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2448h。3觀(guān)察記錄：取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35mL以上對(duì)應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入40％NaOH溶液1020滴，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，放在37℃恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，(用“+”表示)；若不呈紅色，(用“”表示)注意：原試管中留下的培養(yǎng)液供作甲基紅試驗(yàn)用。(二)甲基紅試驗(yàn)()，各加入23滴甲基紅試指示劑，注意沿壁加入，仔細(xì)觀(guān)察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)；若仍成黃色，則為陰性反應(yīng)。(三)吲哚試驗(yàn)1試管標(biāo)記：取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管5支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。2接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，第5管作空白對(duì)照不接種，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)2448h。3觀(guān)察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑(加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀(guān)察)，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。否則為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性用“+”表示，陰性用“”表示。(四) 糖發(fā)酵試驗(yàn)原理：可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫指示劑(，)，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來(lái)判斷是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放人倒置杜氏小管觀(guān)察。1試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌和空白對(duì)照。2接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中，置37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)24h、48h和72h觀(guān)察結(jié)果。3觀(guān)察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏包，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該種菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣．記錄用“▲”表示；如杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“▽”表示。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告1細(xì)菌的生理生化反比試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。2 ，在吲哚試驗(yàn)中加入乙醚，它們各有什么作用？五、問(wèn)題與思考1以上生理生化反應(yīng)能用于鑒別細(xì)菌，其原理是什么?2細(xì)菌生理生化反應(yīng)試驗(yàn)中，為什么要設(shè)空白對(duì)照?3現(xiàn)分離到一株腸道細(xì)菌，試結(jié)合本實(shí)驗(yàn)學(xué)到的知識(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行鑒別。六 演 示1 杜氏小管倒置裝入培養(yǎng)液管中不殘留氣泡的操作過(guò)程。2 分別顯示、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)液陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)結(jié)果的顏色變化情況。七、注意事項(xiàng)1 ．反應(yīng)中加入NaOH溶液和肌酸后要反復(fù)振蕩試管，使空氣中氧溶入培養(yǎng)液中。2甲基紅試驗(yàn)中，不要過(guò)多滴加甲基紅指示別，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。3 吲哚試驗(yàn)中宜選用色氨酸含量高的蛋白胨(用胰蛋白酶水解酪素，得到的蛋白胨中色氨酸含量較高)配制蛋白胨水培養(yǎng)基，否則將影響產(chǎn)吲哚的陽(yáng)性率，在加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管以免破壞乙醚層而影響結(jié)果。4在糖發(fā)酵試驗(yàn)的培養(yǎng)管中裝入倒置杜氏小管時(shí)，注意防止小管內(nèi)有殘留氣泡。滅菌時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)煮沸時(shí)間可除去管內(nèi)氣泡。實(shí)驗(yàn)九 培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟2學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)室滅菌鍋的使用方法二、實(shí)驗(yàn)材料1牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNONaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO4.7H2O。2試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線(xiàn)繩、紗布。3 滅菌鍋三、實(shí)驗(yàn)方法(一)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，瓊脂1520g，水1000mL。1稱(chēng)藥品：按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱(chēng)取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱(chēng)量紙上稱(chēng)量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱(chēng)量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。2加熱溶解：在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3調(diào)PH：檢測(cè)培養(yǎng)基的PH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4過(guò)濾：液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀(guān)察。5分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜，滅菌后垂直待凝。6加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3／5塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。8滅菌：℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫存。9擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜度，使斜度的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)度的1/2。10無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)2448h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用?；騼?chǔ)存于冰箱清潔的櫥內(nèi)，備用。(二) 高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線(xiàn)菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g、NaCl 、MgSO瓊脂l520g，水1000ml，pH 。1 稱(chēng)量和溶解：先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2 PH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。(三)馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：、MgSO蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂1520g，水1000ml，自然pH。1稱(chēng)量和溶解：先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量稱(chēng)取各成分，并將其溶解在少于所需要的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1％的水溶液，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋自胨培養(yǎng)基配制。3鏈霉素的加入：鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45℃左右時(shí)才能加入。可先將鏈霉素配成1％的溶液(配好的鏈霉素溶液保存擴(kuò)20℃)，在100mL培養(yǎng)基中加1％，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)第的名稱(chēng)、數(shù)量，并圖解說(shuō)明其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。五、問(wèn)題和思考1配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？如何進(jìn)行無(wú)菌檢查，3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無(wú)菌檢查。六、演示1培養(yǎng)基的分裝方法。2試管斜面的擱置方法七、注意事項(xiàng)稱(chēng)藥品用的牛角匙不要混用，稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)PH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。實(shí)驗(yàn)十 土壤的稀釋、分離、純化及無(wú)菌操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容1學(xué)習(xí)從上壤中分離微生物的方法，學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)。2用稀釋法分離細(xì)菌、放線(xiàn)茵和霉菌。3用平板劃線(xiàn)法分離微生物。4學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無(wú)菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料1金黃色葡萄球菌和普通變形菌斜面菌種。2已滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶。3無(wú)菌培養(yǎng)皿12套、無(wú)菌EP管10支、土壤樣品、天平、稱(chēng)量紙、藥匙、試管架、記號(hào)筆、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul槍頭、200ul槍頭、20ul槍頭。4無(wú)菌水(、帶玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。三、實(shí)驗(yàn)方法(一)土壤稀釋分離1取土壤