實(shí)驗(yàn)一微生物拮抗作用-資料下載頁
2025-04-04 23:19本頁面
【正文】 過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。一. 儀器 控溫?fù)u床(37℃) 高速冷凍離心機(jī)水浴鍋 冰箱（20℃,‐70℃）超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)箱(37℃) 752分光光度計(jì) 滅菌鍋二. 試劑 CaCl2 無菌水,冰胰蛋白胨 酵母粉 Amp NaCl三. 其他用品移液器， 槍頭 ,50ml 離心管 三角瓶 500ml 200ml 6cm平皿 試劑瓶60ml量筒 燒杯瓊脂 甘油酒精燈 三角玻棒酒精棉球 火柴［溶液配制］ mol/L CaCl2溶液 配置 滅菌LB液體培養(yǎng)基氨芐青霉素（Amp），用無菌水配制成50_60 mg/mL溶液，抽慮滅菌置－20℃冰箱中保存。四. 材料 質(zhì)粒 DNA 五: 實(shí)驗(yàn)步驟：(CaCl2) （20人一班，分三組）第一天：從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中,37℃振蕩培過夜。 第二天：1. mL菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2－3 h(此時(shí)，OD600 ≤ ，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 ≤108／mL。此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，冰上放置10 min。4. 離心10 min（4000r/min）,回收細(xì)胞。4℃5. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。6. mol/L CaCl2 10 mL懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。7. 0－4℃ 6000 r/min,離心10 min，回收細(xì)胞。8. ，（務(wù)必放在冰上）。9. 分裝細(xì)胞，每200 μL一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化：10. 取200 μL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA 2 μL（50 ng ）混勻冰上放置30 min。同時(shí)作兩個(gè)對(duì)照管受體菌對(duì)照：200 μL感受態(tài)細(xì)胞＋2 μL無菌水質(zhì)粒對(duì)照：200 μL mol/L CaCl2溶液＋2 μL 質(zhì)粒DNA溶液11 .將管放到42℃循環(huán)水浴1－2 min。12. 冰浴2 min。13. 每管加800 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h（慢搖）。14. 將適當(dāng)體積（200 μL）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。15. 倒置平皿37℃培養(yǎng)12－16 h，出現(xiàn)菌落。注意 ①無菌操作 ②低溫操作實(shí)驗(yàn)十 重組質(zhì)粒的篩選實(shí)驗(yàn)儀器 控溫?fù)u床 水浴鍋 冰箱（20,‐70℃） 超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)箱 實(shí)驗(yàn)試劑 Amp LB IPTG XGal 平皿 玻棒 三角瓶 離心管 移液器 tip實(shí)驗(yàn)步驟：20人／班 1平皿／人 挑取可疑的白色菌落，移植于2mL的LB中，250轉(zhuǎn)/分搖菌、37℃培養(yǎng)過夜。以快速堿法抽提質(zhì)粒：1． 取適量菌液于2ml指形管中，12000rpm/min離心30s1min。2． 棄上清，且用濾紙吸干。3． 加溶液I100μL，重懸菌體（使細(xì)菌重新溶解）。振蕩。溶液I：含葡萄糖，作用形成粘度和滲透壓。含EDTA，作用是能絡(luò)合Mg+、Ca++，抑制DNA酶活性。含TrisHCL，作用作為平衡鹽。含溶菌酶，作用是溶解細(xì)胞壁。4． 加溶液II200μL，反復(fù)倒轉(zhuǎn)輕搖。溶液II：含NaOH+SDS（現(xiàn)配現(xiàn)用）。作用：，使核酸變性，而質(zhì)粒變性不嚴(yán)重。同時(shí)SDS能使蛋白質(zhì)溶解。5． 加溶液III150μL，倒轉(zhuǎn)輕搖勻。溶液III：含KAC、HAC其作用是使溶液PH達(dá)到中性，染色體退火形成網(wǎng)狀，而質(zhì)粒還原成螺旋狀，溶解在水中。6． 12，000r離心5分鐘。7． 轉(zhuǎn)移上清至另一指形管。8． 加等體積平衡酚（，用TrisNaOH調(diào)），猛烈搖勻，12，000r離心5分鐘。9． 小心轉(zhuǎn)移上清至另一指形管。10． 加1/2體積平衡酚和1/2體積氯仿：異丙醇（氯仿：異丙醇為24：1），混勻，12，000r離心5分鐘。11． 重復(fù)912． 加等體積氯仿：異丙醇抽提，12，000r離心5分鐘。13． 重復(fù)914． 加1/10體積的3MNaAc（），混勻。冰浴若干時(shí)間（時(shí)間可長(zhǎng)可短）。NaAc使質(zhì)粒（帶負(fù)電）電荷減弱，易沉淀。15． 12，000r，15分鐘。16． 棄上清，用75%乙醇1ml洗沉淀。作用：去鹽。17． 離心12，000r，5分鐘。18． 棄上清，風(fēng)干殘留液。19． 加含有RNase的雙蒸水3050μL，溶解沉淀。20． 室溫作用若干時(shí)間，電泳檢測(cè)或置冰箱結(jié)冰層備用。結(jié)果與分析:根據(jù)提取質(zhì)粒酶切后的電泳圖譜, 具體分析是否有插入片段。 有插入片段的為重組子.10 / 1
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