【正文】 微 生 物 實(shí) 驗(yàn) 教 案第一部分 基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊匀旧Ｆ盎罹鸀槔?，熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。二、顯微鏡油鏡使用的原理1普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造（1）光學(xué)部分: 接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大, 造成物象。（2）機(jī)械部分: 鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率（1）放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)（2）顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：D=λ/2nsin(α/2 ) 式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。 λ：可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（）n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。a：鏡口角（即入射角）。3油鏡使用的原理油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。三、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈等。2細(xì)菌三種形態(tài)的玻片染色標(biāo)本。3培養(yǎng)1218h的枯草芽孢桿菌。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1染色細(xì)菌玻片的油鏡觀查（1）用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。（2）調(diào)節(jié)光亮度。（3）低倍鏡觀察：先粗調(diào)再微調(diào)至物象清晰。（4）轉(zhuǎn)入中倍、高倍觀察，每一不只需調(diào)微調(diào)旋紐即可看到清晰的物象。（5）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。（6）繪出所觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖像。（7）、換片：另?yè)Q新片觀察，必須從（3）步開(kāi)始操作。（8）、用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原?；罹破^察取一張干凈的載玻片，在其中央滴上一滴干凈的蒸餾水，取培養(yǎng)1218h的枯草芽孢桿菌一小環(huán)，在水滴上反復(fù)涂抹至菌體充分分散，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的水分，按照油鏡的使用步驟，觀察草芽孢桿菌形態(tài)，邊觀察邊繪圖。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告油鏡使用的原理 六、思考題1油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？2使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？3鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。3觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4觀察時(shí)，兩眼睜開(kāi)，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。5拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。6顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色方法及革蘭氏染色。2了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中的重要性。二、實(shí)驗(yàn)原理1 簡(jiǎn)單染色的原理大多數(shù)微生物細(xì)胞質(zhì)是帶負(fù)電荷，簡(jiǎn)單染色時(shí)采用已知的、帶正電荷的堿性染料。染料適用于熱固定的涂片，染料與菌體細(xì)胞質(zhì)黏附使菌體著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對(duì)比。2 革蘭氏染色的原理革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要有肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，在染色過(guò)程中，當(dāng)用95%乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，細(xì)胞壁的通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞壁內(nèi)而不易脫色，因此呈藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類(lèi)物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類(lèi)物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物容易被乙醇抽提出來(lái)而脫色，然后又被染上了復(fù)染劑的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。三、實(shí)驗(yàn)材料1大腸桿菌24h的斜面培養(yǎng)物。2葡萄球菌24h的斜面培養(yǎng)物。3簡(jiǎn)單染色液（美藍(lán)染色液、黑色素液或炭素墨水）4革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅）5載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。6顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟附表1細(xì)菌染色法分類(lèi)附表2 微生物染色常用染料A酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。B堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。C中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。D單純?nèi)旧哼@類(lèi)染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類(lèi)（Sudan b）的染料簡(jiǎn)單染色(1) 涂片:取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌操作分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調(diào)勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時(shí)不宜過(guò)多，涂片必須均勻。(2) 干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。(3) 固定:于火焰上通過(guò)2—3次。(4) 染色：在整個(gè)涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。（5）水洗：傾去染液，用自來(lái)水細(xì)流沖洗至流下的水中無(wú)染料顏色為止。（6）干燥：空氣中自然干燥或在酒精燈高處微微加熱。（7）鏡檢：在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。2革蘭氏染色（1）涂片。（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。（3）媒染：先用新配的盧哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。（5）復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。（6）鏡檢：觀察染色結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 革蘭氏染色的基本原理和意義2 革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵六、思考題1根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 2制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？3做革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？4當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠?實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的鞭毛染色及其運(yùn)動(dòng)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌鞭毛染色的基本方法及觀察細(xì)菌鞭毛的著生情況。2用壓滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)3用懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)二、實(shí)驗(yàn)原理鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)“器官”，一般細(xì)菌的鞭毛都非常纖細(xì)，在普通光學(xué)顯微鏡的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉淀作用，使染料堆積在鞭毛上，以加粗鞭毛的直徑，同時(shí)使鞭毛著色，在普通光學(xué)顯微鏡下能夠看到。三、實(shí)驗(yàn)材料1 菌種：普通變形桿菌斜面菌種2 鞭毛染色液：A液，B液。3 ％的美藍(lán)水溶液、無(wú)菌水，凹玻片、載玻片，蓋玻片、香柏油、鑷子、酒精燈、擦鏡紙、二甲苯、吸水紙等。四、實(shí)驗(yàn)方法(一) 細(xì)菌鞭毛染色1制片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少許備用的菌苔，最好從菌落的邊緣取菌苔，在載玻片的水滴中輕沾幾下。將載玻片稍?xún)A斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥。2染色：涂片干燥后滴加A液染35分鐘，用蒸餾水沖洗，或?qū)埶疄r干或用B液沖去殘水（注意：一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景很臟）。洗凈A液滴加B液后，將玻片在酒精燈上稍加熱，使其微冒蒸汽且不干，一般染3060秒鐘。然后用蒸餾水沖洗，自然干燥。3鏡檢：鏡檢時(shí)，如未見(jiàn)鞭毛，應(yīng)在整個(gè)涂片上多找?guī)讉€(gè)視野，有時(shí)只在部分涂片上染出鞭毛。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。注意點(diǎn)：染色成功的關(guān)鍵主要決定于：(a)菌種活化的情況，即要連續(xù)移種幾次；(b)菌齡要合適，一般在幼齡時(shí)鞭毛情況最好，易于染色；(c) 新鮮的染色液。（d）制片時(shí)不能加熱固定（二）細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的觀察1 壓滴法(1) 制備菌液：從幼齡普通變形菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放入裝有12mL無(wú)菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。(2) 取23環(huán)稀釋菌液于潔凈載玻片個(gè)央，％的美藍(lán)水溶液，混勻。(3) 用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(4) 鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到觀察部位，再用高倍鏡觀察。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)，后者只是在原處左右擺動(dòng)，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才能判定為有運(yùn)動(dòng)性。2 懸滴法(1) 取潔凈蓋玻片，在四周涂少許凡士林。(2) 在蓋玻片中央滴一小滴菌液(3) 將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，輕輕地蓋在蓋玻片上，使凹玻片與蓋玻片粘在一起(注意液滴不得與凹玻片接觸)。(4) 小心將玻片翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，使菌液正好懸在窩的中央。再用火柴棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。(5) 鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到懸滴的邊緣后，再將菌液移至視野中央，換用高倍鏡觀察，注意細(xì)菌是如何運(yùn)動(dòng)的，它與分子布朗運(yùn)動(dòng)的不同。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告1繪出你所觀察到的細(xì)菌的形態(tài)及鞭毛著生情況。2試描述你所觀察的細(xì)菌有無(wú)運(yùn)動(dòng)性，是如何運(yùn)動(dòng)的？六、思考題 1制片時(shí)為什么不能加熱固定？ 2沒(méi)有鞭毛的活細(xì)菌在光學(xué)顯微鏡下完全不動(dòng)嗎？真實(shí)地記錄你觀察到的現(xiàn)象，并進(jìn)行解釋。3鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?4根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?5試設(shè)計(jì)—實(shí)驗(yàn)，如何鑒別某種細(xì)菌是否能運(yùn)功，是否有鞭毛，其鞭毛的著生位置。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的芽孢、莢膜染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)菌的芽孢染色法。2掌握細(xì)菌的莢膜染色法。二、實(shí)驗(yàn)材料1 枯草芽抱桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。2 二甲苯、香柏油、蒸餾水、5％孔雀綠水溶液、％沙黃水溶液(％堿性復(fù)紅)、繪圖墨水(用濾紙過(guò)濾后備用)、95％乙醇、石炭酸復(fù)紅染液。3顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管()、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟（一）芽孢染色法1方法1(1) 取37℃培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定。(2) 于載片上滴入35滴5％孔雀綠水溶液。(3) 用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開(kāi)始計(jì)算時(shí)間約45min。加熱過(guò)程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。(4) 傾去染液，待玻片冷卻后，用自來(lái)水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5) 用0．5％沙黃水溶液(％堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6) 制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。2 方法2(1) 加12滴自來(lái)水于小試管中，用